РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВ

МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ

СИСТЕМНАЯ ЭНДОТОКСИНЕМИЯ

В ФИЗИОЛОГИИ И ПАТОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

14.00.15 патологическая анатомия

14.00.16 патологическая физиологии

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

в виде научного доклада

Москва – 1993

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ АБРИВИАТУРЫ

АМ- альвеолярные макрофаги

БОС- бронхообструктивный синдром

БТ- бактериальное тело

ГФШ- генерализованный феномен Шварцмана

ДВС- диссеминированное внутрисосудистое свертывание

КС - коронарный спазм

ЛВП- липопротеины высокой плотности

ЛПС - липополисахарид

ОПН - острая почечная недостаточность

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ОРДС- острый респираторный дистресс синдром

ОР - острое респираторное заболевание

ОТ- остаточные тельца

ПЯЛ- полиморфноядерный лейкоцит

СМЛ- системный маргинальный лейкостаз

СЭЕ - системная эндотоксинемия

ТИА- тонкослойный иммунный анализ

ТКС- транзиторный коронароспазм

ЭКГ- электрокардиограмма

ЭСА - эндотоксинсвязывающая активность

ЭФ- эозинофилы

ЭШ - эндотоксиновый шок

TNF- туморнекротизирующий фактор

[ ] - Порядковый номер статьи списка печатных

работ по теме диссертации

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. 1. Актуальность проблемы.

Вторая половина ХХ столетия ознаменовалась не только бурным развитием науки и техники, но и постоянно нарастающим ухудшением условий обитания человека на Земле. Неблагоприятная экологическая ситуация, обусловленная в значительной мере техногенными и социальными факторами, в принципе, не может не сказываться отрицательно на состоянии здоровья населения. С большой долей вероятности можно допустить, что в основе нарастания частоты ряда хронических заболеваний, таких как атеросклероз, аутоиммунные, аллергические и онкологические заболевания, лежат не только чисто медицинские причины, но и постепенно возрастающее загрязнение экзо- и эндоэкологической среды. В этом плане привлекает интерес так называемая нормальная микрофлора кишечника, особенно грамотрицательные бактерии и их эндотоксин - липополисахарид (ЛПС) внешней мембраны клеточной стенки этих бактерий. ЛПС посвящено поистине огромное количество публикаций, обобщенных в недавно изданном четырехтомном руководстве (Handbook оf Endotoxin, Series Editor R.A.Proctor, Elsevie, Amsterdam - New-York - Oxford). Эндотоксин может взаимодействовать с различными клетками макроорганизма, в зависимости от дозы, вызывать их повреждения или стимулировать синтез ряда физиологически активных медиаторов, таких как туморнекротизирующий фактор альфа (TNF), интерлейкин-l и др. Грозными последствиями действия ЛПС являются диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС) и эндотоксиновый шок (ЭШ), весьма часто заканчивающийся летальным исходом. Указанные события, как правило, могут иметь место при так называемом грамотрицательном сепсисе, который всегда сопровождается интенсивной системной эндотоксинемией (СЭЕ). Однако, человек и в физиологических условиях постоянно контактирует с грамотрицательными бактериями и их эндотоксином. Огромным резервуаром этих бактерий и эндотоксина являются, в частности, дистальные отделы кишечника. Как, принято считать, в норме в кровоток из кишечника проникает относительно небольшое количество ЛЛС, который может связываться клетками Купфера, макрофагами, гранулоцитами, тромбоцитами, эритроцитами, антителами, липопротеинами высокой удельной плотности (ЛВП), и некоторыми другими белками плазмы крови.

Связывая эндотоксин, эти факторы предупреждают возможность его токсического действия. Можно предположить, что при различных стрессовых ситуациях, а также при действии различных физических и химических факторов не только увеличивается проницаемость кишечной стенки, но и подавляются функции эндотоксинсвязывающих систем. В подобных ситуациях избыточный выход ЛПС в системный кровоток способен, по-видимому, вызывать серьезные повреждения различных клеток и тканей. Несмотря на очевидную значимость этого механизма до последнего времени истинная роль ЛПС, как и связывающих его систем в физиологии и патологии человека оставалась не ясной. Существенный сдвиг в понимании фундаментальной природы участие ЛПС в жизнедеятельности организма наметился в середине

80-ых годов, когда нами была сформулирована принципиально новая концепция о регуляторной роли ЛПС не только в патологических, но и в защитно-приспособительных реакциях. Указанная концепция опиралась на данные о присутствии ЛПС в портальном кровотоке 45-90% практически здоровых людей (А. Jacob et.al., 1977), способности клеток Купфера элиминировать эндотоксин из портального кpoвoтoкa (D, Knook et al., 1981) ,и данных о том, что в норме до 6% портальной крови, сбрасывается минуя, печень через портокавальные и печеночные шунты в системный кровоток (J.Wolter et.al., 1978). Следовательно было вполне логично предположить, что часть ЛПС может проникать в системный кровоток и участвовать в физиологических процессах, а при массивных поступлениях выступать как общепатологический фактор индуцирующий, развитие самых разнообразных синдромов.

Необходимо при этом подчеркнуть, что изучение роли ЛПС и антиэндотоксиновых систем тормозилось в значительной мере в связи с отсутствием общедоступных методов их обнаружения и оценки активности.

1.2. Цель и задачи работы.

Целью работы явилось изучение роли эндотоксина в физиологии и патологии человека.

Для достижения указанной цели необходимо было решить нижеследующие задачи:

1. Разработать общедоступные методы диагностики системной эндотоксинемии и оценки активности эндотоксин-связывающих систем.

2. Показать реальную клинико-диагностическую значимость количественной оценки содержания эндотоксина и уровня антиэндотоксиновой защиты в системном кровотоке и секционном материале.

З.Осуществить поиск новых химических соединений модулирующих антиэндотоксиновую активность.

1.З. Научная новизна результатов.

Установлено, что при помощи иммуноэнзимной реакции с антителами к гликолипиду Rе-хемотипа в мазках крови можно выявлять лейкоциты, связавшие эндотоксин в организме обследуемого посредством Fс-зависимого механизма. Некоторые гранулоциты сохраняют способность связывать эндотоксин ln vitro при обработке мазков препаратами ЛПС. Содержание лейкоцитов, способных связывать ЛПС in vivo и in vitro, зависит, от наличия на лейкоцитах Fс-рецепторов, антиэндотоксиновых IgG антител, связанных с Fс-рецептором, и от уровня эндотоксинемии.

Основная масса клеток крови связывающих эндотоксин, представлена полиморфноядерными лейкоцитами (ПЯЛ). Супераффинной к эндотоксину клеткой крови является эозинофил.

При помощи иммуноэнзимной реакции с ПЯЛ и разработанной микромодификации ЛАЛ-теста установлено, что эндотоксин в низких концентрациях обнаруживается в крови всех практически здоровых людей, начиная с детского возраста, т.е. выявлена так называемая физиологическая системная эндотоксинемия.

Показано, что состояние клеточного и гуморального иммунитета к эндотоксину четко отражает общее состояние резистентности макроорганизма, наличие различных патологических процессов. Низкие показатели антиэндотоксинового иммунитета и повышенного содержания эндотоксина в крови и тканях наблюдаются при гестозах, при патологии верхних дыхательных путей и легких, при некоторых видах сердечно-сосудистой патологии, при заболеваниях мочевыводящих путей (мочекаменной болезни, аденомы простаты, раке мочевого пузыря), при аппендиците и разлитом перитоните. На основании этих материалов сделано заключение о том, что эндотоксин является общепатологическим фактором, индуцирующим развитие целого ряда патологических процессов в различных органах и тканях. Важную роль в развитии эндотоксин-индуцированной органопатологии играют ЛПС-перегруженные (гиперактивированные) гранулоциты.

Выявлено наличие антиэндотоксин-шоковой активности у некоторых

производных альфа-имидазолилалкилсульфоновой кислоты, которая комбинируется с антикоагулянтной активностью.

1.4. Практическаи ценность полученных результатов.

Разработаны новые методы диагностики эндотоксинемии и оценки антиэндотоксинового иммунитета:

а) микромодификация ЛАЛ-теста для определения эндотоксина в жидких средах - (микро-ЛАЛ-тест);

б) способ обнаружения эндотоксина грамотрицательных бактерий по их взаимодействию с лейкоцитами и выявлению ЛПС-позитивных лейкоцитов при помощи флюоресцирующих антител (ЛПС-тест) - авторское свидетельство N 1749758 (1992 г.);

в) способ выявления антиэндотоксиновых антител при помощи тонкослойного иммунного анализа (ТИА -антиэндотокс);

г) способ оценки иммунитета к эндотоксинам грамотрицательных бактерий по содержанию ЛПС-позитивных лейкоцитов, связавших эндотоксин in vivо и in vitro и выявляемых при помощи иммуноферментной реакции (ЛПС-тест-ИФА) – заявка на получение патента с приоритетом от 13февраля 1993г;

д) способ оценки резистентности организма по показателям титров антител к гликолипиду хемотипа Re и антител к ЛПС с общим антигеном энтеробактерий (иммуноферментая диагностическая тест-система СОИС-ИФА) - положительное решение по заявке на патент N 5050728 от 29 сентября 1992г.

Все эти методы нашли применение в научно-исследовательской работе и клинико-диагностической практике.

ЛПС-тест-ИФА позволяет оценить состояние иммунитета и состояние здоровья у человека и животных, перенесших проникающую радиацию. Иммуноферментная тест-система СОИС-ИФА дает возможность осуществлять раннюю диагностику бессимптомно протекающих заболеваний, в том числе определять группы риска по онкологическим заболеваниям. На ее основе создана технология интенсивного диспансерного наблюдения, которая позволяет оценивать общее состояние здоровья и стоимость страхового полиса, планировать целенаправленные профилактические мероприятия и осуществлять своевременное лечение. Использование системы СОИС-ИФА на Шевченковском заводе пластмасс в 1991 году позволило на 15-20% уменьшить временную нетрудоспособность работников и дало экономический эффект в несколько десятков миллионов рублей. Кроме того, система СОИС-ИФА используется для оценки эффективности лечения и отбора плазмы крови доноров с повышенным содержанием антиэндотоксиновых антител, применение которой в клинике неотложной хирургии значительно снижает частоту осложнений и летальность. Разработаны, по сути дела, основы секционной диагностики системной эндотоксинемии и эндотоксинового шока, которые включают данные анамнеза, клиники и лабораторных исследований, в том числе данные тестов СОИС-ИФА, ЛПС-тест-ИФА, микро-ЛАЛ-тест (в том числе трупной крови), идентификацию ЛПС-позитивных структур в срезах и отпечатках органов при помощи ЛПС-тест-ИФА, выявление маргинального лейкостаза в микрососудах.

Отобраны вновь синтезированные химические соединения, обладающие комплексом биологических активностей, в том числе противошоковой, а также анти- и дезагрегационной активностями, что открывает перспективу их применения для снижения токсического действия бактериальных ЛПС (авторские свидетельства N 1644475 от 22 декабря 1990г. и N 1665676 от 22 марта 1991г.).

Результаты исследований используются в лекционных курсах, диагностической и лекционной практике кафедры патологической анатомии ФУВ Московской медицинской академии, кафедр патологической физиологии Российской медицинской академии последипломного образования и здорового образа жизни, кафедр патологической анатомии, акушерства и гинекологии, патофизиологии, инфекционных болезней и детских инфекций Казанского медицинского института.

1. 5. Основные положения, вынесенные на защиту.

1) Эндотоксин нормальной микрофлоры кишечника, проникающий в системный кровоток в низких концентрациях обеспечивает состояние физиологической системной эндотоксинемии и принимают участие в осуществлении адаптивных реакций, в том числе в формировании пула "активированных" гранулоцитов.

2) Эндотоксин грамотрицательных бактерий является общепатологи ческим фактором, вызывающим и/или участвующим в развитии различных патологических процессов и заболеваний инфекционного и неинфекционного генеза.

3) одним из механизмов развития индуцированной эндотоксином органопатологии является повреждающее действие ЛПС-перегруженных (гиперактивированных) гранулоцитов.

4) Функциональное состояние клеточного и гуморального антиэндотоксинового иммунитета является интегральным показателем общего состояния здоровья человека.

1.6. Апробация работы.

Основные положения работы были доложены и обсуждены на VII Пленуме Правления Всесоюзного Общества патологоанатомов (Казань, 1987), Научно-практической конференции Отдела патанатомии НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосовского (Москва, 1988), VIII Всесоюзном съезде патологоанатомов (Тбилиси, 1989), II Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины" (Латвия, Юрмала. 1989), I Всесоюзной конференции "Патанатомия экстремальных состояний" (Москва, 1991), I Международном симпозиуме-семинаре "Фундаментальные науки и биотехнология страховой медицины (Крым, Меллас, 1992), Международном семинаре "Фирма MSD и СК МАКСС - страховой медицине Татарстана (Казань, 1993), II Международном симпозиуме-семинаре "Фундаментальная наука и биотехнология – страховой медицине" (Москва-Рязань, 1993) и Ученом Совете Института морфологии РАМН.

По теме диссертации выполнено 39 печатных научных работ: получены 3 авторских свидетельства на изобретения; 1 решение о выдаче патента и 1 заявка на выдачу патента принята к рассмотрению.

1.7. Благодарности.

Многие результаты обобщенные в данном докладе, получены в совместных исследованиях с рядом сотрудников НИИ морфологии человека РАМН, НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Казанского медицинского института, Казанского ГИДУВа, Хабаровского медицинского института, ИОФХ Казанского филиала РАН, Республиканского центра экстренной медицинской помощи Минздрава Татарстана, Научно-производственного центра "Гидробиос" Минздрава РФ, медицинского стоматологического института им. Семашко, Центральной республиканской клинической больницы Минздрава РФ, Международного медицинского консорциума "Мечников". Перечень соавторов, участвовавших в проведении отдельных разделов работы, приведен в списке публикаций. Всем им автор выражает глубокую благодарность.

Особую благодарность автор выражает научным консультантам: академику РАМН профессору Н.К. Пермякову и члену-корреспонденту РАМН профессору А.А. Кубатиеву, а также профессору В.Н. Галанкину, профессору В.М. Бондаренко и профессору В.Г. Лиходеду за радость совместной работы и творческого обсуждения результатов. Автор также искренне благодарит своих коллег и помощников А. Н. Крупника., Р.А. Уразаева, В.А. Анохина, Н.О. Крюкова, И.А. Аниховскую и других сотрудников, соискателей и докторантов лаборатории патанатомии экстремальных состояний НИИ морфологии человека РАМН и Международного медицинского консорциума "Мечников".

Автор планировал этапы проведения исследований, руководил всей работой, принимал непосредственное участие в проведении и оценке результатов исследований.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы традиционные клинические, клинико-лабораторные, морфологические (в том числе секционные), биохимические, иммунохимические, иммуноферментные, микробиологические и статистические методы исследований, а также различные методы работы, с экспериментальными животными.

В различных иммунологических исследованиях были использованы препараты гликолипида Rе-хемотипа, полученные из бактерий штамма Salmonella minhessota Re-595 путем экстракции смесью хлороформа с метанолом и конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином, препараты ЛПС 014 с общим антигеном энтеро6актерий, полученные из бактерий Escherichia coli 014, конъюгаты антител к гликолипиду Re-хемотипа с флюоресцеином или пероксидазой хрена, а также коммерческие препараты протеина А и сыворотки против иммуноглобулинов IgG, IgM и Fав-фрагментов иммуноглобулинов человека. В ряде исследований для выявления антител к Rе-гликолипиду были использованы эритроциты, сенсибилизированные Rе-гликолипидом (получены от А.В. Аполлонина). Использованы также электрофоретический анализ различных препаратов ЛПС по Laemmly (1970) и иммуноблотинг по Нго и Ленхофф (1988). Эндотоксинсвязывающую активность липопротеинов высокой удельной плотности определяли по способу, описанному В.Г. Лиходедом и соавторами (1990). Содержание туморнекротизирующегофактора TNF роценивали по методу Deist и соавторов (1988).

Некоторые другие методы исследований приведены в следующих разделах.

Краткая характеристика материалов и методов исследования представлена в таблице 1.

Таблица 1

Краткая характеристика материала и методов исследования

NN раздела	Вид млекопитающего, нозология, объект исслед.,кол-во (n), [n]	Методики
1	2	3
3.1.1.	Человек, практически здоровый, плазма крови, (n > 200). [32]	микро-ЛАЛ-тест
3.1.2.	Человек, пр.здор., кролик интакт. мазки крови (ПЯЛ), (n >200), [3,6,8,10,11,13,14,15]	светооптич.иммуноморфология (флюоресцентная), ЛПС-тест с верификаций азур-эозином
3.1.3.	Человек, пр.здор. (200), больные менингитом (45), мазки крови, (n>300), [33,36]	светооптич.иммуноморфология (ферметная), ЛПС-тест-ИФА
3.1.4.	Человек, пр.здор. (21), ребенок б-ной ОРВИ (7), новорожденный (13) плазма крови (n>500) [32]	тонкосл. иммуноанализ: ТИА-ан-тиэндотокс; РПГА: Антиэндо-токс-1; дот-блот; иммуноблот.
3.1.5.	Человек, пр.здор. (>1000), плазма крови (n>1000)	иммуноферментный анализ: Антиэндотокс-ИФА
3.1.6.	Человек, пр.здор. (5000), больные разл. хрон. заб-ми (293), плазма крови, (n>5000) [34]	иммуноферментный анализ: СОИС-ИФА. Проф. осмотр, спец. диагностические методы исслед.
3.2.	Человек, беремен. пр.здор. (12), с гестозом (59), новорож. (51), родиль-ца (40), плазма кр. (n=103), [6] мазки крови (ПЯЛ) (n>118) [32]	ЛПС-тест СОИС-ИФА ТИА-антиэндотокс
3.3.	Человек, б-ной прост. аппенди-цитом(7),деструкт аппен. с пери-тонитом (26), разлит. перит. (21), плазма крови (n=141), мазки кро-ви(ПЯЛ) (n=78)отпеч. аппенди-кса (n>100) [11, 20, 22, 25, 37, 38]	ЛПС-тест Антиэндотокс-1 Антиэндотокс-ИФА ЛПС-тест-ИФА TNF-тест (по Deist)
3.4.	Человек, дети пр.здор. (20), дети б-ные ОРВИ с глад.теч., осложнен. БОС или пневмонией (319), плазма крови (n>1000), мазки крови (ПЯЛ) (n>1000) сек. набл. (3) [24, 31, 35]	ЛПС-тест Антиэндотокс-ИФА ЛПС-тест-ИФА Микро-ЛАЛ-тест
3.5.	Человек, больные мочекаменной бол-нью (8), хр.пиелонефр. (8), онкол.моч.пузыря (9), ОПН при перетоните (5), мазки крови (n>100), гист. препар. почки (n=60) секц. набл. (7) [10, 17,]	ЛПС-тест ЛПС-тест-ИФА Рутинная гистология
3.6.	Человек, пр.здоровый, больные разн. заб., мазки крови (n>2000), ПЯЛ секц.наблюд. (7); кролик (n>150) при ГФШ и ЭШ: лекгие ПЯЛ, АМ [7,11-18,23,24,27,31]	ЛПС-тест ЛПС-тест-ИФА Фагоцитарные тесты, электронная микроскопия, рутинная гистология
3.7	Кролик, интакт., при ГФШ и ТКС (n>200), внутренние органы, миокард; гист.срезы (n>10000), моделир.ТКС и ИМ(n=57) [1-4, 9, 19, 26]	Рутинная гистология и гистохимия, гистоэнзимология, поляризационная электрокардиография
3.8	Мыши (n>2000) при ЭШ, срезы внутренних органов: (n>5000) [5,21,28,29,30]	Рутинная гистология, специальные методы исслед.

3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка новых способов диагностики эндотоксинемии и оценки активности антиэндотоксиновоro иммунитета.

Определение возможной роли эндотоксина грамотрицательных бактерий в физиологии и патологии человека недостижимо без разработки новых общедоступных методов выявления ЛПС и оценки активности антиэндотоксиновых систем в организме здоровых и больных людей. Решению этих задач посвящена первая часть экспериментальных и клинических исследований.

3.1.1. Выявление эндотоксина при помощи микромодификации теста с пизатом амебоцитов краба рода Limulus (микро-ЛАЛ-тест).

Наиболее распространенным способом определения ЛПС в жидких средах, в том числе в циркулирующей крови в настоящее время является лимулюс-тест (ЛАЛ-тест), основанный на способности ЛПС вызывать коагуляцию белковых фракций лизата амебоцитов краба Limulus polyphenus. Этот тест характеризуется высокой чувствительностью (выявляет до 0.1 пг ЛПС в 1 мл). К недостаткам метода относятся отсутствие строгой специфичности, необходимость применять строго апирогенные растворы и высокая стоимость (10-15 $ в среднем на один анализ). Последнее обстоятельство побудило нас разработать менее дорогую и не менее чувствительную микромодификацию этого теста (совместно с Р.А. Уразаевым; А.Н, Крупником) [32].

Исходным моментом в этой разработке послужило предположение, что при помощи светового микроскопа можно оценить степень кристаллизации белков лизата амебоцитов, которая зависит от концентрации эндотоксина. Это предположение подтвердилось при изучении взаимодействия лизата амебоцитов с растворами, содержащими различные концентрации ЛПС.

Как видно на рис. 1. дисперсность кристаллической сетки зависит от концентрации ЛПС. При этом степень кристаллизации можно оценить в крестах (от + при 2.5 пг/мл эндотоксина до ++++ при концентрации 20.0 пг/мл эндотоксина).

Процедура постановки теста заключается в следующем: кровь забирают в лабораторную посуду, прогретую 3 часа при 300° С в алюминиевой фольге. Кожу перед взятием крови обрабатывают спиртом и апирогенной водой. В кровь добавляют гепарин (10-15 ед/мл), охлаждают до 4°С и центрифугируют 10 мин. при 1000g. Перед постановкой теста плазму крови разводят апирогенной водой, прогревают 10 мин при 80°С, охлаждают, добавляют равный объем разведенного апирогенной водой лизата амебоцитов и полученную смесь инкубируют 45 мин при З7°С. Степень кристаллизации затем оценивают в мазках под микроскопом и концентрацию ЛПС определяют путем сравнения со стандартными образцами, микрофото которых приведено на рис. 1.

Микро-ЛАЛ-тест является полуколичественным и более экономичным, чем обычный ЛАЛ-тест, так как при его постановке на 1 анализ расходуется в 10 раз меньше реактивов. Чувствительность теста - 2.5 пг/ЛПС в 1 мл сыворотки, разведенной 1: 10.

Рис. 1. Микро-ЛАЛ-тест. Дисперсность кристаллической сетки в зависимости от концентрации ЛПС в среде: А - 0 пг/мл; Б - 2.5 пг/мл; В - 5,0 пг/мл; Г - 10.0 пг/мл; Д - 15.0 пг/мл; Е - 20.0 пг/мл. На участке Е - аморфная масса геля в виде темных пятен, в правом нижнем углу - деструкция сетки и свободные от белка зоны (32).

З.1.2.0бнаружение зндотоксина при взаимодействии ЛПС с граиулоцитами крови (ЛПС-тест).

В основу этого метода положена известная (в опытах in vitro) способность ЛПС взаимодействовать и связываться с полиморфноядерными лейкоцитами (ПЯЛ). Мы полагали (и это нашло подтверждение в экспериментах), что при смешивании пробы, содержащей эндотоксин, ПЯЛ, связавшие ЛПС. могут быть выявлены в тонких мазках крови при обработке мазков флюоресцирующими антителами к Rе-гликолипиду, которые способны распознавать ЛПС различных грамотрицательных бактерий.

Тест осуществляют следующим образом: Пробу, содержащую эндотоксин, смешивают с кровью, выдерживают 30 мин при 37°С, готовят тонкий мазок, фиксируют метанолом или этанолом, отмывают солевым раствором, наносят на мазок неконъюгированную сыворотку или плазму крови неиммунизированного животного (для подавления неспецифического связывания Флюоресцирующих антител), отмывают, наносят флюоресцирующую сыворотку, содержащую антитела к Rе-гликолипиду, выдерживают 30 мин, отмывают и микроскопируют в микроскопе Люмам И 1 с иммерсией. При наличии исследуемой пробе эндотоксина на мазке, видны ярко светящиеся участки, в которых расположены лейкоциты (рис.2). Интенсивность люминесценции условно может быть выражена в крестах.

Рис. 2. Ярко светящаяся клетка (слева) и верификация in situ супераффинных к ЛПС (ЛПС-теста) клеток периферической крови с помощью азур-эозина. Интенсивность люминесценции ++++, х 1200.

Если мазок предварительно обработать неконъюгированными антителами к Rе-гликолипиду, а затем флюоресцирующими антителами к гликолипиду, то светящиеся участки отсутствуют, что указывает на специфичность реакции флюоресцирующих анти- Re антител. Чувствительность метода - около 1 пг ЛПС в 1 мл исследуемой пробы. К недостаткам метода следует отнести необходимость работы с УФ микроскопом и микроскопирование мазка сразу после обработки флюоресцирующими антителами, так как интенсивность свечения со временем заметно снижается.

3.1.3. Способ оценки эндотоксинемии и антиэндотоксинового иммунитета по эндотоксиносвязывaющей активности лейкоцитов крови.

Недостатки ЛПС-тест с флюоресцирующими антителами побудили нас видоизменить тест, использовать вместо флуоресцирующих антител антитела к Rе-гликолипиду, конъюгированные с пероксидазой хрена. Так была разработана иммуноферментная модификация теста - ЛПС - тест - ИФА.

В первых же экспериментах по отработке этого теста была выявлена очень интересная закономерность - в мазках крови здоровых животных и людей без смешивания их крови с пробой, содержащей эндотоксин, обнаруживались ПЯЛ, несущие на своей поверхности ЛПС, который выявляется при помощи конъюгированных с ферментом антител к Rе-гликолипиду. Поэтому в дальнейшем мы использовали этот метод для выявления эндотоксина в крови обследуемых.

Кроме того, было установлено, что, если перед обработкой конъюгированными антителами на мазки нанести раствор ЛПС, а уж затем конъюгированные антитела, то количество клеток, несущих ЛПС, увеличивается. В такой модификации метод позволяет определить содержание клеток, связавших эндотоксин in vivo (в организме обследуемого) и содержание клеток, способных дополнительно связывать ЛПС in vitro при обработке мазка раствором ЛПС. Иными словами, метод позволяет оценивать так называемые резервы связывания эндотоксина.

В кратком изложении способ осуществляют следующим образом. У обследуемого берут кровь, готовят два тонких мазка, подсушивают и фиксируют метанолом или этанолом. Для инактивации эндогенной пероксидазы на мазки наносят смесь этанола с 3% перекисью водорода. После отмывания для выявления клеток, способных связывать эндотоксин in vitro, на один из мазков наносят на 30 мин. 1 мл раствора Rе-rликолипида в концентрации 40 мкг/мл. Вслед за отмыванием оба мазка в течение 30 мин. обрабатывают конъюгатом антител к Rе-гликолипиду с пероксидазой, отмывают и на 30 мин. наносят субстрат фермента с красителем, затем снова отмывают, и для выявления ядер клеток мазок окрашивают толуидиновым синим или другим красителем (например: азур-эозином и др. ) для верификации клеток, связавших эндотоксин. При микроскопировании в мазках хорошо видны клетки, несущие на своей поверхности эндотоксин и связавшие конъюгат антител с пероксидазой (рис.3).

Рис. 3. ЛПС-позитивный гранулоцит с дискретно расположенной на поверхности ферментной меткой (справа).

Лейкоцит без ферментной метки (слева). ЛПС-тест-ИФА. х 2000

Эти клетки окрашены в желтоватый цвет. В клетках видны также ядра, окрашенные в синий цвет. При этом в мазке (без нагрузки ЛПС) определяются только ПЯЛ, связавшие эндотоксин in vivo.

Для определения показателей нормы, обследовали 35 здоровых лиц в возрасте 25-50 лет. В среднем было обнаружено 3,5 + 0,4% лейкоцитов, связавших эндотоксин iп vivо, и 8,4 + 0,6% ПЯЛ, несущих ЛПС после обработки мазков эндотоксином iп vitro. При этом предварительная обработка мазков антителами к Rе-гликолипиду, не конъюгированными с .ферментом, снижала количество ЛПС-позитивных ПЯЛ, выявленных при помощи способа ЛПС-тест-ИФА. После сорбции антител к Re-гликолипиду из неконъюгированной сыворотки она утрачивала способность снижать количество ЛПС-позитивных гранулоцитов. Следовательно, ЛПС-тест-ИФА специфически выявляет лейкоциты, несущие ЛПС.

Таким образом, было установлено, что здоровые люди характеризуются наличием умеренной, по-видимому, физиологической СЭЕ (З,5 + 0,4% ЛПС-позитивных ПЯЛ). Кроме того, 4,9% (8,4-3,5%) лейкоцитов способны связывать ЛПС дополнительно, т.е. при обработке мазков iп vitro.

Мы полагали, что значительно большее количество ЛПС-позитивных ПЯЛ можно выявить при инфекционных заболеваниях, вызванных грамотрицательными бактериями, например, у больных бактериальными менингитами в начале заболевания, когда в циркулирующей крови при помощи ЛАЛ-теста всегда обнаруживается эндотоксин. К нашему удивлению при изучении 45 больных менингитом были получены противоположные результаты: при поступлении в клинику содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов, связавших ЛПС in vivo и in vitro было крайне низким (0,1 + 0,03% и 0,1 + 0,04% соответственно). При выписке содержание таких гранулоцитов увеличивалось до 6,8 + 0.9% и 8,1 + 0.5% соответственно. Эти данные позволили предположить, что содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ может отражать не только наличие эндотоксинемии, но и состояние антиэндотоксинового иммунитета.

Приведенные материалы обусловили необходимость изучения механизмов связывания эндотоксина in vivo и in vitro. В связи с этим мазки от здоровых людей обрабатывали сначала сыворотками против IgG, IgM и Fаb фрагментов иммуноглобулинов человека, а затем по способу ЛПС-тест-ИФА. Все эти сыворотки предварительно сорбировали, чтобы удалить антитела к Rе-гликолипиду. Полученные результаты показали, что сыворотки против IgM не влияли на количество ЛПС-позитивных ПЯЛ, связывающих эндотоксин и in vivo и in vitro. в то же время сыворотки против IgG и особенно сыворотки против Fab фрагментов иммуноглобулинов значимо снижали количество гранулоцитов, связавших ЛПС in vivo и количество лейкоцитов, связывающих эндотоксин in vitro. Установлено также, что сыворотка к Re-гликолипиду, не конъюгированная с ферментом, резко снижала количество ПЯЛ, связавших ЛПС in vivo, однако, если такой мазок перед добавлением анти-Rе-конъюгата обрабатывалась Rе-гликолипидом, то количество ЛПС-позитивных лейкоцитов восстанавливалось до нормы.

Эти данные показали, что гранулоциты in vivo и in vitrо связывают эндотоксин при помощи Fc-опосредованного механизма, за счет антител класса IgG, фиксированных на поверхностных Fс-рецепторах лейкоцитов. В связи с этим можно полагать, что содержание ПЯЛ, связавших ЛПС in vivo, и лейкоцитов, способных связать эндотоксин in vitro зависит от степени эндотоксинемии, от наличия на гранулоцитах Fс-рецепторов и связанных с ними антиэндотоксиновых антител класса IgG, т.е. от степени армированности лейкоцитов IgG-антителами. Все это позволяет сделать заключение о защитном характере Fс-зависимого связывания ЛПС гранулоцитами.

Для удобства описания состояний, выявляемых при помощи ЛПС-теста-ИФА, мы применяли следующие условные обозначения:

→ нормальное содержание ЛПС-позитивных гранулоцитов в циркулирующем кровотоке;

↑ повышенное содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов в организме обследуемого;

↓ сниженное содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ в организме обследуемого;

+ наличие лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин при нагрузке ЛПС Rе-хемотипом in vitro;

- отсутствие ПЯЛ, способных дополнительно связывать эндотоксин при нагрузке гликолипидом in vitro.

Обследование больших групп экспериментальных животных и людей показало, что по состоянию антиэндотоксинового иммунитета, оцениваемого при помощи способа ЛПС-тест-ИФА, они могут быть разделены на 6 групп:

Группа 1 (→ +) - характеризуется нормальным содержанием, ЛПС-позитивных лейкоцитов in vivo и наличием ПЯЛ, способных связывать эндотоксин in vitro;

Группа II (↑ +) - повышенное содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов in vitro и наличие гранулоцитов, способных связывать эндотоксин in vitro (группа характеризуется активацией анrиэндотоксинового иммунитетана на фоне компенсированной эндотоксинемии);

Группа III (↑ -) - повышенное содержание эндотоксин-позитивных лейкоцитов in vivо и отсутствие клеток, способных связывать ПЯЛ -in vitro (активация антиэндотоксинового иммунитета на фоне декомпенсированной эндотоксинемии; вследствие того, что антиэндотоксиновый иммунитет не в состоянии полностью компенсировать эндотоксинемию, начинается истощение антиэндотоксинового иммунитета);

Группа IV(→ -) – содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов in vivo находится в пределах нормы, однако резервы дополнительного связывания эндотоксина истощены, т.е. имеет место выраженное истощение, антиэндотоксинового иммунитета;

Группа V (↑ -) - низкое содержание эндотоксин-позитивныХ ПЯЛ in vivo и отсутствие резервов для дополнительного связывания ЛПС in vitro (резкое угнетение антиэндотоксинового иммунитета);

Группа VI (↓ +) - сниженное содержание ЛПС-позитивных гранулоцитов in vivo, однако имеются лейкоциты, способные связывать ЛПС in vitrо (восстановление угнетенного ранее антиэндотоксинового иммунитета).

Схематически эти состояния можно представить следующим образом:

активация иммунитета активация иммунитета

на фоне компенсир. СЭЕ на фоне декомпенсир. СЭЕ

Рис.4. Динамика изменения показателей СЭЕ и анrиэндотоксинового иммунитета по результатам ЛПС-тест-ИФА.

Метод ЛПС-тест-ИФА был использован нами в предварительных исследованиях для оценки состояния антиэндотоксинового иммунитета у лиц, проживающих в районах с повышенным загрязнением радионуклидами: Обследовано 100 таких лиц, а также 100 практически здоровых людей, проживающих в г.Москве. В каждую группу были включены лица обоих полов в возрасте 18-45 лет. По содержанию ЛПС-позитивных ПЯЛ они были разделены на 6 описанных групп (табл.2).

Таблица 2

Состояние антиэндотоксинового иммунитета у лиц в

загрезненных радионуклидами в районах и в г.Москве.

Группы	Состояние иммунитета	Количество лиц
		в загрезненных районах	в Москве
1 2 3 4 5 6	→ + ↑ + ↑ - → - ↓ - ↓ +	9 18 37 8 16 12	66 12 10 9 2 1
Общее кол-во лиц в группах 3, 4, 5		61	21
Общее кол-во лиц в группах 1, 2, 6		39	79

Как видно из табл. 2, в зоне с повышенным содержанием радионуклидов большинство обследованных (61%) относится к группам 3, 4, 5, которые характеризуются наличием декомпенсированной эндотоксинемии и угнетением антиэндотоксинового иммунитета. В то же время в Москве к таким группам было отнесено лишь 20% обследованных. При анализе анамнестических данных и дополнительных обследованиях у лиц, отнесенных к группам 3, 4, 5 в 70% случаев обнаружены острые и хронические заболевания органов дыхания, пищеварения, выделительной системы, дисбактериоз. Следовательно, иммуноферментная тест-система ЛПС-тест-ИФА может быть использована при диспансеризации и оценке состояния здоровья людей, в т. ч. облученных.

З.l.4. Определение титров антиэндотоксиновых антител при помощи диагностической тест-системы "ТИА-антиэндотокс".

. В ряде экспериментов для определения титров антител, связывающих эндотоксин, мы использовали диагностическую тест-систему "Антиэндотокс-1", разработанную В. Г. Лиходедом и соавторами (1983). Эта система представляет собой формалинизированные и таниназированные бараньи эритроциты, сенсибилизированные гликолипидом Rе-хемотипа в комплексе с бычьим сывороточным альбумином. Система хорошо работает в РПГА, например при отборе высокотитражных образцов плазмы крови доноров, однако применение ее для обследования больных с острой патологией бывает затруднительно из-за возможности ложнопозитивных неспецифических реакций за счет белков острой фазы. В связи с этим, мы разработали (совместно с Р.А.Уразаевым, А.Н.Крупником) [32] новую диагностическую тест-систему "ТИА-антиэндотокс", которая основана на определении титров антител к Rе-гликолипиду методом тонкослойного иммунного анализа. Для постановки реакции полистироловые чашки Петри сенсибилизировали раствором Rе-гликолипида. а затем свободные участки на полистироле насыщали бычьим сывороточным альбумином и заливали 1% агаром Дифко. На поверхность агара наносили образцы исследуемых сывороток и через 16-18 часов оценивали зоны преципитации, которые становились хорошо заметными после кратковременного выдерживания чашек над горячим паром (рис.5).

Титр анти-Rе-антител можно при этом оценивать путем нанесения на агар различных разведений сыворотки (или плазмы) или путем измерения диаметра зоны преципитата при нанесении цельной сыворотки:

диаметр зоны титр сыворотки

0.9 мм 1:2

до 1.9 мм 1:4

до 2,8 мм 1:8

до 3.9 мм 1: 16

до 4.9 мм 1:32

до 5.9 мм 1:64

до 6.9 мм 1:128

до 7. 9 мм 1: 256 .

При сравнительном обследовании тест-система "ТИА-антиэндотокс" по чувствительности в несколько раз превышала РПГА с эритроцитарным диагностикумом «Антиэндотокс-1», но на 1-2 порядка уступала чувствительности иммуноферментной тест-системы «Антиэндотокс-ИФА».

Рис. 5. Зоны специфической конденсации паров при проведении тонкослойного иммуноанализа (ТИА-антиэндотокс). Величина диаметра прямо

соответствует титру антител.

3.1.5. Выявление антиэндотоксиновых антител при помощи иммуноферментной тест-системы "Антиэндотокс-ИФА".

С целью повышения чувствительности способа определения титров антител к гликолипиду, Rе-хемотипа мы разработали иммуноферментную диагностическую тест-систему «Антиэндотокс-ИФА" (совместно с Р.А.Уразаевым, А.Н.Крупником). Для этого.полистироловые планшеты для иммунологических реакций сенсибилизировали раствором Rе-гликолипида, затем в лунки вносили по 250 мкг буфера для разведения и по 16 мкг исследуемой сыворотки или плазмы крови. После инкубирования и промывания в лунки вносили 150 мкг протеина А, конъюгированного с пероксидазой хрена, инкубировали, промывали, добавляли субстрат с красителем и содержание антител определяли по показателю экстинции при длине волны 405 нм. При каждом определении в качестве контроля (нормы) использовали пул плазмы крови от 43 здоровых доноров. Способ позволяет выявлять антитела к Rе-гликолипиду класса IgG, c которыми связывается протеин А..

3.1.6. Оценка антиэндотоксинового иммунитета при помощи диагностической тест-системы "СОИС-ИФА".

Основанием для разработки этой системы послужили отдельные наблюдения того, что оценка иммунного статуса является более полной при одновременном определении титров антител к Re-гликолипиду и антигену ЛПС 014 с общим антигеном энтеробактерий. В связи с этим мы создали способ оценки иммунного статуса, основанный на применении иммуноферментной тест-системы "СОИС-ИФА" [34]. Для этого определяют содержание антител к Rе-гликолипиду при помощи тест-системы "Антиэндотокс-ИФА" и содержание антител к ЛПС 014 и общему антигену энтеробактерий. В последнем случае полистироловые планшеты для иммунологических исследований сенсибилизируют антигеном, выделенным из клеток Escherichia coli 014 (получен от В. М.Бондаренко), а все последующие операции проводят как при использовании системы «Антиэндотокс-ИФА".

При этом определяют показатель Е1, характеризующий содержание IgG-антител к Rе-гликолипиду, и показатель Е2, характеризующий содержание IgG-антител к антигену ЛПС014 и общему антигену энтеробактерий, а также показатель

П = Е2 / Е1,

определяющий отношение показателя Е2 к показателю Е1. В качестве нормы в каждом исследовании определяют показатели Е1, Е2 и П для пула образцов плазмы от 43 здоровых доноров. Отклонением от нормы считали увеличение или уменьшение показателей не менее чем на 2 сигмы.

С целью апробации метода СОИС-ИФА было проведено обследование 293 практически здоровых людей (рабочих и служащих производственного объединения "ТАСМА" в Г.Казани) - полученные результаты позволили разделить обследованных на 11 групп следующим образом (табл.3).

Для контроля объективности обследования целенаправленно привлекались следующие специалисты: терапевт, кардиолог, пульмонолог, акушер-гинеколог, гастроэнтеролог, окулист, невропатолог. По показаниям проводились ультразвуковое исследование, гастрофиброскопия, ЭКГ. Проведено 227 анализов на раково-эмбриональный антиген, антиген рака молочной железы, альфа-фетопротеин, углеводный антиген злокачественных опухолей панкреато-гепато-дуоденальной области, кислую фосфатазу предстательной железы, бета-2-микроглобулин, ХГЧ, ЛГ, ФСГ, эстрадиол, прогестерон, тестостерон, ТТГ, тироксин, трийодтиронин, кортизол. 23 человека дообследовались в стационарных условиях. Больные с острыми заболеваниями в состав обследованных не входили. Результаты обследования специалистами представлены в табл.3.

Таблица 3

Показатели антител к Re-гликолипиду (Е1), ЛПС с общим антигеном энтеробактерий (Е2) и их соотношение (П) у сотрудников ПО «ТАСМА»

Группы обследованных	Количество обследованных	Показатели
		Е1	Е2	П
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11	34 10 20 22 29 63 4 18 30 17 46	→ ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ → ↓ ↑ →	→ ↓ ↓ ↑ ↑ ↑ ↓ ↓ → → ↑	→ → ↑↓ → ↑↓ ↑ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑
Всего 293

Обозначения: → норма, ↓ ниже нормы, ↑ выше нормы

Таблица 4

Частота выявления диспансерных больных в группах «СОИС-ИФА» (в %)

№ группы	Число обследован.	Нозологическая форма
		Фибро-миомы	Язвен. б-нь	Узлов. зоб и узлов. масто- патия	Пиело- нефрит	Хрон. пнев- мония	Ревма- тизм	Кисты и по- липы разл. орг.	Зло- кач. ново- образ.
1	34	-	-	2,9	-	-	-	-	-
2	10	10,0	-	-	10,0	-	-	-	-
3	20	15,0	15,0	-	20,0	-	10,0	30,0	-
4	22	4,5	-	9,0	13,6	-	-	13,6	-
5	29	17,2	13,8	10,3	20,7	3,4	3,4	6,9	3,4
6	63	19,0	3,2	7,2	15,9	4,8	4,8	11,6	1,4
7	4	-	-	-	-	-	-	-	-
8	18	16,7	11,1	-	5,6	-	-	22,2	5,6
9	30	6,7	6,7	-	10,0	3,3	3,3	-	-
10	17	35,3	11,8	13,0	11,8	-	-	11,8	-
11	46	2,2	4,3	4,3	8,7	-	-	2,1	-
Всего 293

Как видно из табл. 4, различные хронические заболевания (диспансерные больные) наиболее часто выявляются в группах З, 5, 6, 8, 10, которые можно отнести к группам риска.

Состояние резистентности организма по результатам обследования при помощи тест-системы "СОИС-ИФА" в группах можно оценить следующим образом: при нормальных значениях Е1, Е2 и П состояние резистентности оценивают как нормальное (1-я группа); при снижении Е1 и Е2 и нормальном значении П - как физиологический вариант нормы (2-ая группа); при снижении Е1 и Е2 и снижении или повышении П - как вариант угнетения резистентности (3-ья группа); при повышении Е1 и Е2 и, нормальном значении П - как вариант физиологической активации резистентности (4-ая группа); при повышении Е1 и Е2 и повышении или снижении П - как вариант дисбалансированной активации резистентности (5-ая группа); при снижении Е1, повышении Е2 и П - как вариант активации селективно сниженной резистентности (6-я группа); при повышении Е1, снижении Е2 и П как вариант дисбалансированной активации селективно сниженной резистентности (7-ая группа); при нормальном значении Е1, снижении Е2 и П - как вариант декомпенсированного снижения резистентности (8-я группа); при снижении Е2, нормальном значении Е2 и повышении П - как вариант компенсированного снижения резистентности (9-ая группа); при повышении Еl, нормальном значении Е2 и снижении П - как вариант декомпенсированной активации сниженной резистентности (10-я группа); при нормальном значении Е1, повышении Е2 и П - как вариант компенсированной активации измененной резистентности (11-ая группа). Предлагаемый способ применялся при обследовании более чем 5 000 рабочих и служащих ВИАМ и завода низковольтной аппаратуры (г.Москва), производственного объединения "Тасма" (г.Казань), Шевченковского завода пластических масс (г.Актау) и ряда других предприятий СНГ. Способ позволил выявить "группы риска", латентно протекающие формы болезни, состояния предболезни. Способ не требует дорогостоящего оборудования, прост в исполнении, позволяет повысить эффективность профилактики и лечения, сократить потери по временной нетрудоспособности.

Вместе с тем необходимо отметить, что для разностороннего теоретического объяснения результатов, получаемых способом "СОИС-ИФА", при сопоставлении частот патологических процессов в выявленных группах резистентности организма с показателями титров антител, необходимы дальнейшие исследования. В частности, следует сопоставить результаты одновременного обследования разных групп населения, здоровых и больных при помощи системы ЛПС-тест-ИФА и "СОИС-ИФА". Эти исследования пока не проведены в связи с более поздней разработкой системы ЛПС-тест-ИФА.

3.2. Эндотоксинемия и антиэндотоксиновый иммунитет у беременных женщин и новорожденных.

В своих исследованиях мы прежде всего попытались оценить возможную роль эндотоксина в период беременности, в частности, роль эндотоксина при поздних токсикозах беременности. Первые данные, свидетельствующие об участии ЛПС в патогенезе поздних гестозов, были нами опубликованы в 1987 году. У 48 из 59 женщин в мазках периферической крови определялись ПЯЛ, перегруженные ЛПС. Последующие исследования (проведенные в нашей лаборатории Д.В.Добронецкой), осуществленные при помощи микро-ЛАЛ-теста и ТИА-антиэндотокса, показали, что при гестозах беременность и послеродовый период протекают на фоне повышенного по сравнению с контролем (беременные без токсикоза) содержания эндотоксина в крови и сниженного содержания антиэндотоксиновых антител. Эти данные подтверждают участие СЭЕ патогенезе этой патологии.

Далее было изучено содержание эндотоксина в плазме и титры антиэндотоксиновых антител у матерей и новорожденных спустя 1 сутки после родов. Они были разделены на группы в зависимости от состояния новорожденных: здоровые дети (группа1) и их матери (группа 4); дети с физиологическими реакциями адаптации (группа2) и их матери (группа 5), дети с патологическими реакциями адаптации (группа 3) и их матери (группа 6).

Как видно из таблицы 5, в контрольных (здоровых) группах детей (группа 1) содержание эндотоксина в плазме крови было значительно меньше, чем у детей с физиологическими (группа 2) и патологическими (группа 3) реакциями адаптации. Патологические реакции адаптации протекают на фоне снижения титра, антиэндотоксиновых антител (группа 3). Необходимо отметить, что у детей группы 3 с уменьшением патологических реакций адаптации снижалось содержание эндотоксина в плазме и к моменту выписки домой (14 дней после родов в среднем) нарастали титры анти тел к Re-гликолипиду.

Можно полагать, что эндотоксин является одной из возможных патофизиологических причин развития реакции адаптации. Кроме того, необходимо отметить наличие СЭЕ у новорожденных вскоре после рождения, что может быть следствием колонизации организма грамотрицательной микрофлорой

Таблица 5

Содержание эндотоксина и антиэндотоксиновых антител в плазме крови новорожденных и их матерей [32]

Обследованные	Группа	Количество обследованных	Содержание ЛПС (пг/мл)	Обратные титры антител к Re-гликолипиду
Дети	1 2 3	26 13 22	1.2+0.4 *6.0+1.5 *8.2+1.2	22.9+3.1 *60.3+10.1 10.2 + 2.3
Матери	4 5 6	21 8 11	2.4+0.9 ***1.3+0.5 6.8 +1.9	16.4+2.6 **96.0+26.4 47.3+14.9

* - Р<0.05 по отношению к 1-ой группе

** - Р<0,05 по отношению к 4-ой группе

*** - Р<0;05 по отношению к 6-ой группе

Следует отметить, что и в более позднем периоде у детей имеет место СЭЕ, по-видимому, физиологическая, и в плазме крови содержатся антиэндотоксиновые антитела. При изучении здоровых 20 детей в возрасте от 1,5 до 3 лет были определены следующие показатели:

Содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов 4.2 + 1.15%

Содержание эндотоксинав в плазме 1.36 + 0.61 пг/мл

Обратные титры антител к Rе-гликолипиду 16.8 + 3.39.

Эти данные позволяют заключить, что эндотоксин антиэндотоксиновый иммунитет играет важную роль в физиологии и патологии беременных женщин и новорожденных.

3.3. Эндотоксин и эндотоксинсвязывающие системы при аппендиците и разлитом перитоните.

Первые результаты, свидетельствующие об участии ЛПС в патогенезе аппендицита, были опубликованы, нами в 1989. Они были получены с помощью ЛПС-теста (реакция считалась положительной при наличии ЛПС-перегруженных ПЯЛ с интенсивностью люминесценции +++, ++++). Так, при остром неосложненном аппендиците эндотоксин-перегруженные гранулоциты определялись в 16.6%, а при остром деструктивном - в 87.5% наблюдений. Наличие ЛПС-гиперактивированных ПЯЛ в периферической крови у больных с острым неосложненным аппендицитом при отсутствии четко выpаженных морфологических признаков воспаления отростка может свидетельствовать в пользу того, что СЭЕ предшествует лейкоцитарной инфильтрации тканей аппендикса и его деструктивным изменениям. Способность ЛЩ-перегруженных гранулоцитов проявлять аутоагрессивные свойства (см. 3, 6.), присутствие ЛПС в кишечнике и наличие разнообразных факторов, способных быть причиной повреждения слизистой аппендикса и развития СЭЕ, позволило нам предположить, что патогенез острого аппендицита аналогичен местному феномену Шварцмана. В пользу этого предложения свидетельствовало наличие в отпечатках флегмонозно-измененного аппендикса ЛПС-перегруженных гранулоцитов (рис.6).

Рис.6. ЛПС-перегруженный гранулоцит в отпечатке аппендикса при флегмонозном воспалении. х 2000 ЛПС-тест-ИФА.

Для оценки роли эндотоксина при разлитом перитоните в крови больных определялось содержание туморнекротизирующего фактора (ТNF), который, как известно, является основным медиатором токсического действия ЛПС. Исследован 21 больной: 15 выздоровевших (1-ая гр.) и 6 умерших (2-ая гр.). Результаты исследования приведены в таблице 6.

Из таблицы 6 следует, что в первые сутки послеоперационного периода концентрация, TNF в группах сравнения была одинаковой. К 5 суткам содержание TNF у выздоровевших больных, в отличие от умерших, снижается (Р<0,001), что свидетельствует о важной роли ЛПС в патогенезе заболевания и возможности использования показателей содержания TNF в прогностических целях.

Таблица 6

Концентрация ТNF в крови у больных разлитым перитонитом.

Группа	Концентрация в ед/мл (М±m)
	Срок исследования (в днях)
	1	3	5
1-ая (n=15)	82,3±6,3	74,4±5,1	* ** 32,3±4,8
2-ая (n=6)	85,6±7,7		92,0±8,3

Примечание:

n - число обследованных

* - Р<0,001 - к исходному уровню;

** -Р<0,001 - к умершим.

Исследования перитонеального экссудата (В.В.Струсов и соавт.1993) обнаружившие параллелизм между концентрацией TNF в крови и в брюшной полости свидетельствуют о том, что основным продуцентом токсического фактора при разлитом перитоните являются перитонеальные макрофаги, подлежащие удалению из брюшной полости.

Прямое определение ЛПС при помощи ЛАЛ-теста показало. что у 70 больных разлитым перитонитом концентрация эндотоксина в крови при перитонитах значительно повышена и колеблется в пределах от 7,8 ± 3,3 ед.опт.пл. до 14.6 ± 4.8 ед.опт.пл. После проведения экстракорпоральной детоксикации, дающей хороший терапевтический эффект содержание ЛПС снижалось в разных группах больных до 4.9 ± 0.8 и 6.4± 1.4 ед.опт.пл.

Исходя из важной роли ЛПС в патогенезе разлитого перитонита была изучена возможность лечения больных плазмой крови с высоким содержанием антител к Re-гликолипиду. Результаты представлены в таблицах 7 и 8.

Больным 1 группы вводили обычную плазму крови доноров, а больным 2 группы - плазму с высоким (титры 1: 64 - 1: 256) содержанием антител к Rе-гликолипиду (титры определяли в РПГА при помощи эритроцитарного .диагностикума "АНТИЭНДОТОКС-1"). Больные перитонитом при поступлении в клинику характеризовались резко сниженным гуморальным антиэндотоксиновым иммунитетом. Титры антиэндотоксиновых антител начинали возрастать через 5-7 суток после операции и при лечении плазмой крови с повышенным содержанием антител к Rе-гликолипиду. Титры таких антител во 2 группе к 10-15 суткам после операции возрастали до значений нормы. Применение антиэндотоксиновой плазмы крови доноров снижало частоту осложнений после операции и уменьшало продолжительность пребывания больных в клинике (табл.7).

Положительная динамика антиэндотоксиновых антител, регистрируемых методом СОИС-ИФА, наблюдалась также при благоприятном течение перитонита в связи с гангреной тонкой кишки (табл.8).

Таблица 7

Характеристика больных острым аппендицитом, осложненным распространенным перитонитом

№		1 гр.n =14	2 гр. п=12
1	а) гангренозный б) гангренозно-перфоративный	6 8	4 8
2	Xap-p флоры брюшной полости: а) кишечная палочка + протей б) синегнойная палочка в) признаки анаэроб. флоры	13 + 1 = 14 - 4	10 + 1 = 11 1 5
3	Летальность	1	-
4	Послеопер. осложнения: а) инфильтраты брюш. полости б) абсцессы брюшной полости в) эвентрации г) нагноение раны	7 2 1 6	3 1 - 3
5	Койко-дни (средние показат. )	31,2	26,7

Таблица 8

Титры антител к Re-гликолипиду у больных перитонитом

Время обследования	Обратные титры антител
	1 группа	2 группа
При поступлении 1-3 сутки после операции 5-7 сутки после операции 10-15 сутки после операции	2.5 + 0,1 Р1<0,01 2.7+ 0;3 Р1<0,01 4.1+ 0.3 Р1<0,01 9,0.+ 0.9 Р1<0,05	2,7 + 0,2 Р1<0,01 2,3 + 0.2 Р1<0;01 8.8 + 0,6 Р1<0,01 18.3 + 2,2 Р2<0,05
Показатели нормы	19,5 + 0,4

Примечание: Р1 - значимость различий по сравнению с нормой;

Р2 - значимость различий между группами.

В то же время у больных, умерших от перитонита, показатели титров антител к Rе-гликолипиду оставались на крайне низком уровне. Так, по данным СОИС-ИФА у 11 человек, выздоровевших от перитонита, содержание антител к Rе-гликолипиду было повышенным, в то время как у 8 погибших от перитонита содержание таких антител было крайне низким (рис. 8). Эти данные достаточно убедительно свидетельствуют о важной протективной роли антиэндотоксиновых антител при перитонитах.

Рис.7. Динамика показателей содержания IgG-антител против Rе-гликолипида (а) и E.col1 (б) в плазме крови (в ед.опт.плот) в остромпериоде гангрены тонкой кишки с перитонитом. Исход болезни выздоровление. Столбики: средние показатели у здоровых. СОИС-ИФА.

Рис.8.Величина экстинции IgG К Rе-гликолипиду у выздоровевших

(-○--) и умерших (--●--) больных перитонитом. СОИС-ИФА.

В своем большинстве, изученные нами случаи перитонитов развивались как осложнения аппендицита.

Совокупность полученных нами результатов позволяет сделать заключение, что эндотоксин непосредственно вовлекается в патогенез перитонита и обусловливает в значительной мере тяжесть его клинического течения, в то время как антиэндотоксиновые антитела играют важную защитную роль при этой патологии.

3.4. Эндотоксинемия и антиэндотоксиновый иммунитет при патологии легких.

Анализ материалов литературы, включающей экспериментальные и клинические наблюдения, позволил предположить возможность участия эндотоксина в различных видах патологии легких. В этом плане вызывал интерес бронхообструктивный синдром (БОС) при острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ), в частности у детей. Мы обследовали 44 ребенка в возрасте от 4 месяцев до 10 лет, больных ОРВИ.У 20 детей ОРВИ была осложнена БОС, у остальных наблюдалось гладкое течение ОРВИ. Было изучено содержание антиэндотоксиновых антител методом ТИА-антиэндотокс, содержание эндотоксина в плазме микро-ЛАЛ-тестом и содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ, выявленных способом ЛПС-тест и ЛПС-тест-ИФА (совместно с В. А. Анохиным, Р. А. Уразаевым и др.).

Из табл. 9 видно, что у больных детей титр антиэндотоксиновых антител в начале заболевания несколько снижен. При осложненных формах ОРВИ наблюдается медленное нарастание титров по мере выздоровления. Более информативны данные о содержании плазменного и клеточно-связанного ЛПС (табл. 10). У всех больных ОРВИ показатели количества ЛПС-позитивных лейкоцитов и содержания эндотоксина в плазме оказались значительно более высокими, чем у здоровых детей. Особенно высокими были показатели содержания ЛПС-позитивных ПЯЛ. Наибольшее содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов у больных ОРВИ, осложненной БОС, было отмечено в первые 5 дней заболевания, в это же время было отмечено наименьшее содержание эндотоксина в плазме крови.

В первые 5 дней заболевания у больных с БОС была наиболее клинически выражена интоксикация и наблюдалась корреляция между тяжестью заболевания с БОС и содержанием ЛПС-позитивных ПЯЛ.

Были обследованы также дети, у которых ОРВИ осложнялась пневмонией. Средние показатели у таких больных по сравнению с группой больных без пневмонии представлены в таблице 11-13.

Таблица 9

Содержание антител к Re-гликолипиду у детей с ОРВИ, осложненной и неосложненной БОС (n = 101)

Дни заболевания	log2 обратного титра антител к Rе-гликолипиду
	ОРВИ без БОС	ОРВИ с БОС
1 – 3 4 – 5 6 – 10 Позднее 10	2,87 + 0.43 3,37 + 0,47 2,87 + 0,31 3,14 + 0,58	2.50 + 0,66 2,61 + 0.56 2,87 + 0,35 3,62 + 0.58
Здоровые дети(20)	6.55 + 0,28

Таблица 10

Показатели СЭЕ при ОРВИ у детей раннего возраста (n=101)

Дни забо левания	Содержание эндотоксина в плазме (пг/мл)		Содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ (B %),
	ОРВИ без БОС	ОРВИ с БОС	ОРВИ без БОС	ОРВИ с БОС
1 - 3 4 – 5 6 – 10 позднее 10	8.75 + 2.05 8.21 + 1.85 7.66 + 1.35 10.09 + 1.61	2.52 + 1.61 1.82 + 0.72 3.09 + 1.47 5.83 + 2.38	12.90 + 5.16 11.50 + 3.45 9.26 + 2.16 8,00 + 1.98	34.42 + 8.42 25.15 + 6.29 13.94 + 4.39 13.71 + 4.72
Здоровые дети (20)	1.36 + 0.61		4.20 + 1.15

Таблица 11

Титры антиэндотоксиновых антител у больных ОРВИ детей с пневмонией и без пневмонии (n=218)

Дни заболевания	log2 обратных титров антител к Rе-гликолипиду
	ОРВИ без осложнения	ОРВИ с Пневмонией
1 – 3 4 – 5 6 – 10 позднее10	2.78 + 0.28 2,48 + 0.40 2.99 + 0.21 3.26 + 0.41	3,20 + 0.73 2,00 + 0.43 2.61 + 0,30 2,11 + 0.43
3доровые дети	3,55+ 0.28

Из табл.11 видно, что титры антиэндотоксиновых антител у больных ОРВИ особенно у больных с пневмонией были крайне низкими. Содержание эндотоксина в плазме в первые 5 дней заболевания было более высоким у больных с пневмонией, а содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов у них бы-ло более высоким и после 10-го для заболевания (табл.12).

Нужно заметить, что у всех больных показатели плазменной СЭЕ и содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ были более высокими, чем у здоровых детей. Обращает на себя внимани также тот факт, что клинические проявления интоксикации у тяжелых больных ОРВИ с пневмонией коррелируют с концентрацией эндотоксина в плазме крови (табл. 13).

Таблица 12

Содержание эндотоксина и ЛПС-позитивных лейкоцитов при ОРВИ с пневмонией (n=218)

Дни болезни	Содержание эндотоксина в плазме (пг/мл)		Содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ (в%)
	ОРВИ без пневмонии	ОРВИ с пневмонией	ОРВИ без пневмонии	ОРВИ с пневмонией
1 – 3 4 – 5 6 – 10 Позднее 10	6.3+ 1.34 6.9 + 1.36 7.18 +1.00 10.05 +1.38	10.651+ 2.38 12.04+2.89 6.85+ 2.16 3.76 + 1.22	12.74+ 3.26 13.91+ 2.78 11.43+ 2.13 6.42+ 2.19	4.48+ 2.26 13.27+ 3.92 16.83+4.85 11.18+ 3.07
Здоров.дети	1.36+ 0.61		4.2+ 1.15

Таблица 13

Содержание плазменного эндотоксина у детей, больных ОРВИ с пневмонией (n=38)

Наличие интоксикации	Концентрация эндотоксина плазме крови. пг/мл
Отсутствие Выраженная интоксикация	4.24 + 1.22 13.34 + 2.22
Здоровые дети	1.36 + 0.61

Принципиально такие же наблюдения были сделаны при обследовании взрослых с ОРВИ, осложненной пневмонией. У этих больных была выявлена прямая зависимость между температурой тела и содержанием эндотоксина в плазме крови и обратная зависимость между температурой, тела и содержанием антител к эндотоксину (рис. 9).

Изложенные материалы на наш взгляд достаточно убедительно свидетельствуют о роли эндотоксина в развитии интоксикационного синдрома при заболеваниях дыхательных путей, а также об участии эндотоксина в механизме развития бронхообструктивного синдрома.

Рис.9. Динамика концентрации плазменного ЛПС (■ ) и титра антиRе-антител(■ ) в зависимости от температуры тела. Микро-ЛАЛ-тест, ТИА-антиэндотокс.

Особо необходимо отметить важную роль ЛПС-позитивных ПЯЛ при изучаемой патологии. В частности, в первые три дня развития пневмонии количество ЛПС-позитивных ПЯЛ почти в три раза меньше, чем при неосложненной ОРВИ. Этот факт может быть объяснен миграцией эндотоксин-активированных гранулацитов в легкие, т.к. именно в этот периад и происхадит лейкоцитарная инфильтрация легких – формируется марфологическая картина банального воспаления органа. Именно в этот период, развития заболевания в системном кровотоке обнаруживается большое количество ЛПС-позитивных в том числе (ЛПС-перегруженных) гранулоцитов на фоне более чем пятикратного увеличения концентрации плазменного ЛПС. Причем значительное снижение свободного эндотоксина на 6-10 день развития пневмонии сопровождается почти четырехкратным увеличением количества ЛПС-позитивных ПЯЛ при исчезновении из системного кровотока эндотоксин-перегруженных гранулоцитов. Создается впечатление того, что именно гиперактивированные ПЯЛ и птветственны за развитие осложнения ОРВИ. Механизм развития воспаления при ОРВИ может быть представлен следующим образом: повреждение ("протрава") вирусом эпителиальных клеток, легких и сенсибилизация поврежденной ткани ЛПС (который всегда присутствует во вдыхаемом воздухе) - выброс хемаатрактантов - инфильтрация органа ЛПС-активированными лейкоцитами (в том числе и гиперактивированными аутоагрессивными, см. 3.6.) - деструктивные изменения - типичная морфологическая картина пневмонии. В связи с этим возникает справедливый вопрос. - Почему при ОРВИ резко возрастает концентрация ЛПС в системном кровотоке? По-видимому, это происходит в результате повреждения вирусом эпителия слизистой кишечника. Возможность развития пневмонии при ОРВИ по предложенному нами механизму находит свое подтверждение на секционном материале аспирационной пневмонии (рис. 12) новорожденного, осложнившейся кровоизлиянием в надпочечники (классическая картина эндотоксинового шока, - синдрома Уотерхаза-Фридрихсена): наличие свободного эндотоксина на стенке альвеолы и инфильтрация ткани ЛПС-позитивными ПЯЛ. Не менее интересен и другой факт, - несомненного участия ЛПС-позитивных ПЯЛ в патогенезе бронхообструктивного синдрома при ОРВИ.

Полученные результаты, свидетельствуют о важной (если не ведущей) роли СЭЕ и, в частности ЛПС-позитивных ПЯЛ, в патогенезе острого респираторного дистресс-синдрома (РДС), патогномоничными признаками которого являются как БОС, так и альвеолит.

3.5. Эндотоксин и патология мочеполовой системы

Обобщенные О.Westphal(1975) данные литературы свидетельствуют о важной роли почек в выведении эндотоксина из системного кровотока. Так, при внутривенном введении кролику ЛПС моча приобретает выраженную пирогенную активность. Однако, до настоящего времени неизвестно, какой эндотоксин выводят почки: плазменный ("свободный") или гранудоцит-связанный? Более того, неизвестно какие же структуры мочевыводящей системы ответственны за это? Клубочковый аппарат? Слизистые оболочки лоханок, мочеточников, мочевого пузыря? Или те и другие? Также не определена роль ЛПС в патогенезе острой почечной недостаточности (ОПН) и других видах патологии почек у человека.

Хорошо известно, что ОПН является практически облигатным синдромом шокового процесса любой этиологии в т.ч. эндотоксиновой.

Наши немногочисленные секционные исследования почек при эндотоксиновой патологии, осложненной ОПН, (рис. 10а) показали наличие ЛПС в эпителии, выстилающем клубочковую капсулу Шумлянского-Боуэна, и эпителии проксимальных канальцев. Обнаруженные данные являются прямым свидетельством участия клубочкового аппарата в выведении плазменного ЛПС и, возможно, участия свободного эндотоксина в патогенезе деструктивных изменений, лежащих.в основе развития некронефроза. Мы допускаем возможность того, что именно ЛПС является ответственным за развитие полиурической фазы ОПН. В связи с обнаружением нами эндотоксина в эпителии капсулы клубочкового аппарата весьма интересным представляются результаты исследований G.Morell соавт. [1988], изучавших патогенез ЛПС-индуцированного повреждения почек на изолированном клубочке, которые показали, что ЛПС может быть причиной развития гломерулонефрита. Кроме того, нефротоксический эффект при остром перитоните с ОПН может осуществляться ЛПС-позитивными гранулоцитами (рис. 10б), т.к. эндотоксин-гиперактивированные ПЯЛ обладают полным спектром необходимых для этого биологических свойств и способны сами по себе обусловливать развитие всей гаммы морфологических и клинических нарушений в почках при изучаемой патологии. Подтверждением этого может служить наличие

ЛПС-перегруженных гранулоцитов у аналогичных по тяжести течения заболевания больных острым перитонитом с ОПН и при хроническом пиелонефрите в периферической крови на 2-3 день болезни, а также nриведенные выше данные о резком угнетении антиэндотоксинового иммунитета при разлитом перитоните.

Рис. 10. Почки при геморрагическом инфаркте кишечника с острым перитонитом и ОПН. ЛПС-тест-ИФА. х 400: а) наличие ЛПС в эпителии капсулы Шумлянского-Бауэна и в некротизированных эпителиальных клетках проксимальных канальцев; б) ЛПС-позитивные гранулоциты в интерстиции (слева) и в микрососудах (справа) с явлениями маргинального лейкостаза.

На участие эндотоксина в ренальной патологии косвенно указывают также имеющиеся у нас данные о значительном угнетении гуморального антиэндотоксинового иммунитета при хронической почечной недостаточности.

Об этом же свидетельствуют и факты наличия в периферической крови ЛПС-перегруженных ПЯЛ при различной нефро-урологическои патологии: у25% больных хроническим пиелонефритом (в стадии ремиссии), 33% больных с онкологическими заболеваниями мочевого пузыря в раннем послеоперационном периоде и, что наиболее интересно, - 87% больных мочекаменной болезнью.

Таким образом, почки принимают участие в выведении эндотоксина из системного кровотока. Естественно предположить, что нарушение этого механизма с фиксацией эндотоксина в различных структурах нефрона не может не играть существенной роли в патогенезе заболевания почек и других органов урогенитальной системы. Особое место в реализации патогенного эффекта эндотоксина, по-видимому, принадлежит ЛПС-перегруженным гранулоцитам.

3.6. Эндотоксин и система полиморфноядерных лейкоцитов

Клетки крови различных видов млекопитающих имеют не одинаковую чувствительность к эндотоксину. Наибольшей аффинностью по отношению к ЛПС обладают кроличьи тромбоциты и гранулоциты, а также крысиные мононуклеарные фагоциты, наименьшей - человеческие тромбоциты и эритроциты.

Реакция человеческих гранулоцитов на ЛПС во многом аналогична кроличьей. Справедливость этого была подтверждена нами в предварительных. опытах in vitro на популяции лейкоцитов, которые активно акцептировали бактериальные липополисахариды. Более того верификация in situ ЛПС-позитивных клеток в 500 мазках периферической крови больных с разлитым гнойным перитонитом, хроническим пиелонефритом, очаговой и крупозной пневмонией, травматическим кардиогенным и ожоговым шоком, поздним токсикозом беременности с нефротическим синдромом, мочекаменной болезнью и др. с помощью гематологических окрасок обнаружила весьма любопытный факт: у большинства больных в периферической крови обнаруживались ПЯЛ с высокой интенсивностью люминесценции, что, как правило сопровождалось лихорадкой, изменениями биохимических и гематологических показателей крови. Определялся сдвиг лейкоцитарной формулы влево различной степени выраженности, лейкопения, но чаще лейкоцитоз. У большинства больных в мазках периферической крови практически отсутствовали эозинофилы (ЭФ). У части пациентов отмечалась тромбоцитопения и нередко активация тромбоцитарного ростка (появление бластных форм) костного мозга и др. При просмотре мазков периферической крови наше внимание было привлечено к чрезвычайно ярко светящимся клеткам, намного превосходящим по яркости аффинные к ЛПС ПЯЛ. Клетки встречались далеко не в каждом мазке. Оказалось, что они обнаруживаются в мазках крови, в которых присутствовали единичные ЭФ. Верификация этих супераффинных к ЛПС клеток показала, что ими являются ЭФ (рис. 2). По-видимому, ЛПС и является одним из основных факторов, обусловливающих развитие эозионопении, так как с одной стороны СЭЕ - весьма частое клиническое явление, а с другой - хорошо известна способность ЛПС оказывать лейкопенический эффект с депонированием (секвестрацией) ПЯЛ в микроциркуляторном русле паренхиматозных органов, и, в первую очередь, - в легких. В связи с этим весьма интересны клинические исследования (Наlgеn R. et. аl), показавшие, что в патогенезе повреждения легких при септическом шоке с развитием острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) определенная роль принадлежит ЭФ и, в частности, освобождаемому ими специфическому гранулярному белку - эозинофильному катионному протеину. Плазменная концентрация этого белка значительно возрастает (несмотря на эозинопению), что на наш взгляд может служить ранним диагностическим критерием развивающегося при септическом шоке ОРДС.

Таким образом, полиморфноядерные лейкоциты являются основной эндотоксин-связывающей популяцией.клеток крови, а эозинофил будучи еще более активной к ЛПС-клеткой, может опосредовать патогенный эффект СЭЕ.

При исследовании с помощью ЛПС-ТЕСТа и ЛПС-ТЕСТ-ИФА мазков крови более чем 1000 практически здоровых и больных людей обратило на себя внимание обязательное присутствие в периферической крови различного количества слабо ЛПС-позитивных ПЯЛ. Первоначально этот факт трактовался нами как артефакт (или расценивался как фон), однако проведение самых разнообразных контрольных исследований, включая иммуноблотинг и дот-блот, мы сочли возможным по-иному подойти к оценки этого факта.

Материалом для исследования послужила кровь практически здоровых людей и больных с т.н. грамотрицательными флегмонами нижней челюсти, перитонитом и ОРДС (выполнено совместно с В.Н.Галанкиным.,А.Н.Крупником., А..М.Токмаковым). Исследования морфо-функциональной активности ПЯЛ осуществлялись при помощи методики, разработанной В.Н.Галанкиным с соавт. [1987]: в 5 мл гепаринизированной (20 МЕ/мл гепарина) венозной крови измеряли рН и определяли число ПЯЛ; добавляли в пробирку с кровью бактериальную взвесь, суточной культуры, музейного штамма стафилококкА (10⁹ микробных тел/мл) с рН, равной рН крови, из расчета 10 микробных тел на 1 ПЯЛ; кровь, смешанную с бактериями, инкубировали 30 мин в термостате при температуре тела обследуемого, встряхивали через каждые 10 мин., затем готовили первую серию мазков для изучения поглотительной способности ПЯЛ на светооптическом уровне; остаток крови инкубировали не встряхивая еще 120 мин. при тех же условиях. Через 120 мин. инкубации готовили вторую серию мазков для изучения бактерицидной способности ПЯЛ. Далее проводили фиксацию материалов для электронно-микроскопического исследования по методу, описанному H.Azar и соавт.

Рис.11.Ультраструктура ПЯЛ человека из тест-системы с лейкоцитарно-бактериальной взвесью через 120 мин после добавления бактерий (Staphylococus epedermitis 9198) х 18000. а - умеренно активированный ПЯЛ: не формирует обширных вакуолей, содержащих окружающий клетки субстрат. Активность соответствует задачам переваривания бактерий - в цитоплазме остаточные тельца (ОТ) от переваренных бактерий; б - гиперактивированный ПЯЛ: Формирует обширные вакуоли, содержащие хлопьевидный материал. Степень активации превышает необходимую для выполнения фагоцитарной функции - бактерии перевариваются хуже, одно из бактериальных тел (БТ) не имеет признаков деструкции.

Результаты ультраструктурных исследований позволили разделить ПЯЛ на три группы – неактивированные, умеренно активированные и гиперактивированные (В.Н.Галанкин и coaвт., 1988). В норме в крови доноров находится определенное количество ЛПС-позитивных гранулоцитов и сопоставимое число умеренно активированных ПЯЛ.

Неактивированные ПЯЛ имели правильную округлую форму без псевдоподий, сохранные первичные и вторичные гранулы, не способны к захвату дозированно-добавленных в тест-систему бактерий. Умеренно активированныe ПЯЛ - (рис. 11а) характеризовались способностью образовывать псевдоподии типа лобоподий, формировать облегающие бактериальные тела фагосомы, обладали организованным выбросом содержимого гранул в просвет фагосом, хорошим перевариванием бактерий в тест-системе в течение 120 минут. Полученные данные свидетельствуют о важной роли ЛПС в поддержании системы ПЯЛ в состоянии физиологического тонуса, и, соответственно, - в формировании антибактериального гомеостаза в здоровом организме.

Становятся объяснимыми малопонятные с позиций фагоцитарной теории данные о наличии в крови здоровых людей активированных ПЯЛ. Причины и смысл этой активации находится в полном соответствии с общими закономерностями деятельности физиологических систем: воздействие (в данном случае проникновение ЛПС из кишечника в кровь в обычных условиях) уравновешивается действием транспортно-элиминирующих систем, в том числе системы ПЯЛ, и одновременно поддерживает системы в состоянии физиологического тонуса.

Вместе c тeм, при изучаемой патологии, сопровождающейся лихорад- кой, сдвигом лейкоформулы влево, гипер- или гипокоагуляцией и увеличением плазменного эндотоксина в системном кровотоке отмечалось появление ЛПС-перегруженных ПЯЛ. Одновременно с этим, выявлялись гиперактивированные ПЯЛ. Ультраструктурно (рис. 11б) гиперактивированные ПЯЛ характеризуются образованием нитевидных псевдоподий и обширных неправильной формы мешковидных фагосом, иногда с разрушением их мембран, выходом содержимого гранул непосредственно в цитоплазму с развитием очагового цитолиза. Появляются вакуоли, не содержащие объект фагоцитоза, которые очевидно лишены функционального значения и являются проявлением сверхактивации мембран, возникает значительное количество липидных включений в цитоплазме - как свидетельство деградации гликолипидов .мембран клетки: ухудшаются процессы переваривания микробов в течение120 минут. Гиперактивация ПЯЛ, связаннаяная с возникновением сверхвысокой текучести мембран отражает нарушение внутри- клеточных регуляторных механизмов фагоцитоза, приводит, к неэкономному расходованию бактерицидного потенциала клетки, снижению ее функциональной активности и, по нашему мнению, может обусловливать аутоагрессивность ПЯЛ как по отношению к самим себе, так и окружающим их клеткам и тканям.

Обнаруженные нами морфо-функциональные изменения ПЯЛ согласуются с литературными данными (полученными в экспериментах in vitro и in vivo) о способности ЛПС воздействовать на функциональные возможности ПЯЛ и, порой, их извращать.

Многочисленные публикации, как и собственные данные морфологических исследований экспериментального (эндотоксиновый шок на кроликах) и секционного (перитонит и др.) материала подтверждают выдвинутую нами концепцию участия ЛПС-позитивных. ПЯЛ в патогенезе эндотоксин-индуцированной патологии.

Исследования легочной ткани кролика обнаружили, что уже спустя 30 минут после инфузии ЛПС количество ПЯЛ в микрососудах значительно увеличивается, большинство гранулоцитов, находящихся в маргинальном cocтоянии, ЛПС-позитивны, при этом отмечается незначительный oтeк интерстиция. Выраженность последнего значительно возрастает к 1 часу исследования, когда обнаруживаются признаки повреждения эндотелия (набухание его, десквамация), петехиальные кровоизлияния, лериваскулярный отек, что происходит на фоне нарастания явлений маргинального лейкостаза и появления ЛПС-лозитивных ПЯЛ в интерстиции. К 5 часу наблюдения секвестрация ПЯЛ в микрососудах легких достигает своего максимума. Десквамация эндотелия наиболее выражена, нарастают явления периваскулярного и интерстициального отека, увеличивается количество интерстициальных ПЯЛ. Единичные ЛПС-позитивные ПЯЛ появляются в просвете альвеол и мелких бронхов, выявляются признаки повреждения пневмоцитов и явления дистелектазов, носящие очаговый характер. Эти изменения нарастают к 10 часу наблюдения и достигают своего максимума к концу первых суток исследования. Часть маргинальных интерстициальных ЛПС-позитивных ПЯЛ имеют признаки повреждения. Резкий отек интерстиция, периваскулярных пространств и паренхимы сочетается с петехиальными кровоизлияниями и наличием в альвеолярных пространствах ЛПС-позитивных ПЯЛ и альвеолярных макрофагов (АМ). Отмечаются повреждения пневмоцитов и прогрессирование дистелактазов. Таким образом, выведение ЛПС из легких (и организма) реализуется системой ПЯЛ, которая играет важную роль и в повреждении легочной ткани. В связи с этим приобретает важное значение определение роли АМ в механизме осуществления дренажной функции легких при СЭЕ, тем более, что и ЛПС-активированные макрофаги могут быть важным фактором повреждения органа.

Взаимодействие ЛПС-позитивных ПЯЛ с альвеолярными макрофагами (АМ) изучалось в исследованиях in vitro. АМ выделялись из бронхоальвеолярного лаважа с последующей очисткой в смеси Фиколл-верографин, а ПЯЛ - из цельной стабилизированной крови того же кролика, отстаивавшейся при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем клетки инкубировали в растворе Хенкса (рН=7,4) жизнеспособность их оценивалась по эксклюзии метиленового зеленого и составляла не менее 90%. Выделенные ПЯЛ в количестве 8х10 инкубировали с раствором ЛПС (2 мг/мл) в течение 1 часа при 37°С (жизнеспособность клеток не снижалась), трижды отмывали путем центрифугирования в растворе Хенкса, а затем инкубировали со взвесью АМ в количестве 4х10 1 час при 37º С (1 серия). Три других серии эксперимента были контрольными; 2)АМ инкубировали с неактивированными ЛПС ПЯЛ; 3)АМ инкубировали с раствором Хенкса; 4)АМ инкубировали 1 час с различными растворами ЛПС (от 0,0005 до 5,0 мг/мл) – с целью определения токсичных для АМ доз ЛПС. Соответственно приготавливали в каждом случае по три мазка, которые исследовались методом люминесцирующих антител к R-гликолипиду, с последующей верификацией клеток по Май-Грюнвальду, а в 4 серии определялась жизнеспособность АМ по эксклюзии метилового синего. Для блокировки свободных Fс-фрагментов клеток перед инкубацией с люминесцирующими антителами использовалась баранья сыворотка. Для исключения аутолюминесценции отобранные поля предварительно исследовались.

В 1 серии иммуноморфологическое исследование обнаружили наличие ЛПС в 80% AМ, тогда как во 2 и 3 сериях он определяется лишь в 5% АМ. В ЛПС-позитивных АМ 1 серии обнаружена значительная вакуолизация цитоплазмы, точечные просветления в ядре и увеличение ворсинчатости клеточной мембраны. Часть ЛПС-позитивных ПЯЛ поглощается видимо АМ целиком. Последнее представляется весьма важным фактором, поскольку чувствительность АМ к ЛПС значительно выше, чем у ПЯЛ (при инкубации с 0.5 мг/мл ЛПС жизнеспособны, только 50% АМ при 0,05 мг/мл - 70% АМ), а гибель АМ может быть фактором повреждения легких. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о возможности передачи JЩС от ПЯЛ к АМ и/или фагоцитозе АМ ПЯЛ.