РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВ

МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ

СИСТЕМНАЯ ЭНДОТОКСИНЕМИЯ

В ФИЗИОЛОГИИ И ПАТОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

14.00.15 патологическая анатомия

14.00.16 патологическая физиологии

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

в виде научного доклада

Москва – 1993

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ АБРИВИАТУРЫ

АМ- альвеолярные макрофаги

БОС- бронхообструктивный синдром

БТ- бактериальное тело

ГФШ- генерализованный феномен Шварцмана

ДВС- диссеминированное внутрисосудистое свертывание

КС - коронарный спазм

ЛВП- липопротеины высокой плотности

ЛПС - липополисахарид

ОПН - острая почечная недостаточность

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ОРДС- острый респираторный дистресс синдром

ОР - острое респираторное заболевание

ОТ- остаточные тельца

ПЯЛ- полиморфноядерный лейкоцит

СМЛ- системный маргинальный лейкостаз

СЭЕ - системная эндотоксинемия

ТИА- тонкослойный иммунный анализ

ТКС- транзиторный коронароспазм

ЭКГ- электрокардиограмма

ЭСА - эндотоксинсвязывающая активность

ЭФ- эозинофилы

ЭШ - эндотоксиновый шок

TNF- туморнекротизирующий фактор

[ ] - Порядковый номер статьи списка печатных

работ по теме диссертации

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. 1. Актуальность проблемы.

Вторая половина ХХ столетия ознаменовалась не только бурным развитием науки и техники, но и постоянно нарастающим ухудшением условий обитания человека на Земле. Неблагоприятная экологическая ситуация, обусловленная в значительной мере техногенными и социальными факторами, в принципе, не может не сказываться отрицательно на состоянии здоровья населения. С большой долей вероятности можно допустить, что в основе нарастания частоты ряда хронических заболеваний, таких как атеросклероз, аутоиммунные, аллергические и онкологические заболевания, лежат не только чисто медицинские причины, но и постепенно возрастающее загрязнение экзо- и эндоэкологической среды. В этом плане привлекает интерес так называемая нормальная микрофлора кишечника, особенно грамотрицательные бактерии и их эндотоксин - липополисахарид (ЛПС) внешней мембраны клеточной стенки этих бактерий. ЛПС посвящено поистине огромное количество публикаций, обобщенных в недавно изданном четырехтомном руководстве (Handbook оf Endotoxin, Series Editor R.A.Proctor, Elsevie, Amsterdam - New-York - Oxford). Эндотоксин может взаимодействовать с различными клетками макроорганизма, в зависимости от дозы, вызывать их повреждения или стимулировать синтез ряда физиологически активных медиаторов, таких как туморнекротизирующий фактор альфа (TNF), интерлейкин-l и др. Грозными последствиями действия ЛПС являются диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС) и эндотоксиновый шок (ЭШ), весьма часто заканчивающийся летальным исходом. Указанные события, как правило, могут иметь место при так называемом грамотрицательном сепсисе, который всегда сопровождается интенсивной системной эндотоксинемией (СЭЕ). Однако, человек и в физиологических условиях постоянно контактирует с грамотрицательными бактериями и их эндотоксином. Огромным резервуаром этих бактерий и эндотоксина являются, в частности, дистальные отделы кишечника. Как, принято считать, в норме в кровоток из кишечника проникает относительно небольшое количество ЛЛС, который может связываться клетками Купфера, макрофагами, гранулоцитами, тромбоцитами, эритроцитами, антителами, липопротеинами высокой удельной плотности (ЛВП), и некоторыми другими белками плазмы крови.

Связывая эндотоксин, эти факторы предупреждают возможность его токсического действия. Можно предположить, что при различных стрессовых ситуациях, а также при действии различных физических и химических факторов не только увеличивается проницаемость кишечной стенки, но и подавляются функции эндотоксинсвязывающих систем. В подобных ситуациях избыточный выход ЛПС в системный кровоток способен, по-видимому, вызывать серьезные повреждения различных клеток и тканей. Несмотря на очевидную значимость этого механизма до последнего времени истинная роль ЛПС, как и связывающих его систем в физиологии и патологии человека оставалась не ясной. Существенный сдвиг в понимании фундаментальной природы участие ЛПС в жизнедеятельности организма наметился в середине

80-ых годов, когда нами была сформулирована принципиально новая концепция о регуляторной роли ЛПС не только в патологических, но и в защитно-приспособительных реакциях. Указанная концепция опиралась на данные о присутствии ЛПС в портальном кровотоке 45-90% практически здоровых людей (А. Jacob et.al., 1977), способности клеток Купфера элиминировать эндотоксин из портального кpoвoтoкa (D, Knook et al., 1981) ,и данных о том, что в норме до 6% портальной крови, сбрасывается минуя, печень через портокавальные и печеночные шунты в системный кровоток (J.Wolter et.al., 1978). Следовательно было вполне логично предположить, что часть ЛПС может проникать в системный кровоток и участвовать в физиологических процессах, а при массивных поступлениях выступать как общепатологический фактор индуцирующий, развитие самых разнообразных синдромов.

Необходимо при этом подчеркнуть, что изучение роли ЛПС и антиэндотоксиновых систем тормозилось в значительной мере в связи с отсутствием общедоступных методов их обнаружения и оценки активности.

1.2. Цель и задачи работы.

Целью работы явилось изучение роли эндотоксина в физиологии и патологии человека.

Для достижения указанной цели необходимо было решить нижеследующие задачи:

1. Разработать общедоступные методы диагностики системной эндотоксинемии и оценки активности эндотоксин-связывающих систем.

2. Показать реальную клинико-диагностическую значимость количественной оценки содержания эндотоксина и уровня антиэндотоксиновой защиты в системном кровотоке и секционном материале.

З.Осуществить поиск новых химических соединений модулирующих антиэндотоксиновую активность.

1.З. Научная новизна результатов.

Установлено, что при помощи иммуноэнзимной реакции с антителами к гликолипиду Rе-хемотипа в мазках крови можно выявлять лейкоциты, связавшие эндотоксин в организме обследуемого посредством Fс-зависимого механизма. Некоторые гранулоциты сохраняют способность связывать эндотоксин ln vitro при обработке мазков препаратами ЛПС. Содержание лейкоцитов, способных связывать ЛПС in vivo и in vitro, зависит, от наличия на лейкоцитах Fс-рецепторов, антиэндотоксиновых IgG антител, связанных с Fс-рецептором, и от уровня эндотоксинемии.

Основная масса клеток крови связывающих эндотоксин, представлена полиморфноядерными лейкоцитами (ПЯЛ). Супераффинной к эндотоксину клеткой крови является эозинофил.

При помощи иммуноэнзимной реакции с ПЯЛ и разработанной микромодификации ЛАЛ-теста установлено, что эндотоксин в низких концентрациях обнаруживается в крови всех практически здоровых людей, начиная с детского возраста, т.е. выявлена так называемая физиологическая системная эндотоксинемия.

Показано, что состояние клеточного и гуморального иммунитета к эндотоксину четко отражает общее состояние резистентности макроорганизма, наличие различных патологических процессов. Низкие показатели антиэндотоксинового иммунитета и повышенного содержания эндотоксина в крови и тканях наблюдаются при гестозах, при патологии верхних дыхательных путей и легких, при некоторых видах сердечно-сосудистой патологии, при заболеваниях мочевыводящих путей (мочекаменной болезни, аденомы простаты, раке мочевого пузыря), при аппендиците и разлитом перитоните. На основании этих материалов сделано заключение о том, что эндотоксин является общепатологическим фактором, индуцирующим развитие целого ряда патологических процессов в различных органах и тканях. Важную роль в развитии эндотоксин-индуцированной органопатологии играют ЛПС-перегруженные (гиперактивированные) гранулоциты.

Выявлено наличие антиэндотоксин-шоковой активности у некоторых

производных альфа-имидазолилалкилсульфоновой кислоты, которая комбинируется с антикоагулянтной активностью.

1.4. Практическаи ценность полученных результатов.

Разработаны новые методы диагностики эндотоксинемии и оценки антиэндотоксинового иммунитета:

а) микромодификация ЛАЛ-теста для определения эндотоксина в жидких средах - (микро-ЛАЛ-тест);

б) способ обнаружения эндотоксина грамотрицательных бактерий по их взаимодействию с лейкоцитами и выявлению ЛПС-позитивных лейкоцитов при помощи флюоресцирующих антител (ЛПС-тест) - авторское свидетельство N 1749758 (1992 г.);

в) способ выявления антиэндотоксиновых антител при помощи тонкослойного иммунного анализа (ТИА -антиэндотокс);

г) способ оценки иммунитета к эндотоксинам грамотрицательных бактерий по содержанию ЛПС-позитивных лейкоцитов, связавших эндотоксин in vivо и in vitro и выявляемых при помощи иммуноферментной реакции (ЛПС-тест-ИФА) – заявка на получение патента с приоритетом от 13февраля 1993г;

д) способ оценки резистентности организма по показателям титров антител к гликолипиду хемотипа Re и антител к ЛПС с общим антигеном энтеробактерий (иммуноферментая диагностическая тест-система СОИС-ИФА) - положительное решение по заявке на патент N 5050728 от 29 сентября 1992г.

Все эти методы нашли применение в научно-исследовательской работе и клинико-диагностической практике.

ЛПС-тест-ИФА позволяет оценить состояние иммунитета и состояние здоровья у человека и животных, перенесших проникающую радиацию. Иммуноферментная тест-система СОИС-ИФА дает возможность осуществлять раннюю диагностику бессимптомно протекающих заболеваний, в том числе определять группы риска по онкологическим заболеваниям. На ее основе создана технология интенсивного диспансерного наблюдения, которая позволяет оценивать общее состояние здоровья и стоимость страхового полиса, планировать целенаправленные профилактические мероприятия и осуществлять своевременное лечение. Использование системы СОИС-ИФА на Шевченковском заводе пластмасс в 1991 году позволило на 15-20% уменьшить временную нетрудоспособность работников и дало экономический эффект в несколько десятков миллионов рублей. Кроме того, система СОИС-ИФА используется для оценки эффективности лечения и отбора плазмы крови доноров с повышенным содержанием антиэндотоксиновых антител, применение которой в клинике неотложной хирургии значительно снижает частоту осложнений и летальность. Разработаны, по сути дела, основы секционной диагностики системной эндотоксинемии и эндотоксинового шока, которые включают данные анамнеза, клиники и лабораторных исследований, в том числе данные тестов СОИС-ИФА, ЛПС-тест-ИФА, микро-ЛАЛ-тест (в том числе трупной крови), идентификацию ЛПС-позитивных структур в срезах и отпечатках органов при помощи ЛПС-тест-ИФА, выявление маргинального лейкостаза в микрососудах.

Отобраны вновь синтезированные химические соединения, обладающие комплексом биологических активностей, в том числе противошоковой, а также анти- и дезагрегационной активностями, что открывает перспективу их применения для снижения токсического действия бактериальных ЛПС (авторские свидетельства N 1644475 от 22 декабря 1990г. и N 1665676 от 22 марта 1991г.).

Результаты исследований используются в лекционных курсах, диагностической и лекционной практике кафедры патологической анатомии ФУВ Московской медицинской академии, кафедр патологической физиологии Российской медицинской академии последипломного образования и здорового образа жизни, кафедр патологической анатомии, акушерства и гинекологии, патофизиологии, инфекционных болезней и детских инфекций Казанского медицинского института.

1. 5. Основные положения, вынесенные на защиту.

1) Эндотоксин нормальной микрофлоры кишечника, проникающий в системный кровоток в низких концентрациях обеспечивает состояние физиологической системной эндотоксинемии и принимают участие в осуществлении адаптивных реакций, в том числе в формировании пула "активированных" гранулоцитов.

2) Эндотоксин грамотрицательных бактерий является общепатологи ческим фактором, вызывающим и/или участвующим в развитии различных патологических процессов и заболеваний инфекционного и неинфекционного генеза.

3) одним из механизмов развития индуцированной эндотоксином органопатологии является повреждающее действие ЛПС-перегруженных (гиперактивированных) гранулоцитов.

4) Функциональное состояние клеточного и гуморального антиэндотоксинового иммунитета является интегральным показателем общего состояния здоровья человека.

1.6. Апробация работы.

Основные положения работы были доложены и обсуждены на VII Пленуме Правления Всесоюзного Общества патологоанатомов (Казань, 1987), Научно-практической конференции Отдела патанатомии НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосовского (Москва, 1988), VIII Всесоюзном съезде патологоанатомов (Тбилиси, 1989), II Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины" (Латвия, Юрмала. 1989), I Всесоюзной конференции "Патанатомия экстремальных состояний" (Москва, 1991), I Международном симпозиуме-семинаре "Фундаментальные науки и биотехнология страховой медицины (Крым, Меллас, 1992), Международном семинаре "Фирма MSD и СК МАКСС - страховой медицине Татарстана (Казань, 1993), II Международном симпозиуме-семинаре "Фундаментальная наука и биотехнология – страховой медицине" (Москва-Рязань, 1993) и Ученом Совете Института морфологии РАМН.

По теме диссертации выполнено 39 печатных научных работ: получены 3 авторских свидетельства на изобретения; 1 решение о выдаче патента и 1 заявка на выдачу патента принята к рассмотрению.

1.7. Благодарности.

Многие результаты обобщенные в данном докладе, получены в совместных исследованиях с рядом сотрудников НИИ морфологии человека РАМН, НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Казанского медицинского института, Казанского ГИДУВа, Хабаровского медицинского института, ИОФХ Казанского филиала РАН, Республиканского центра экстренной медицинской помощи Минздрава Татарстана, Научно-производственного центра "Гидробиос" Минздрава РФ, медицинского стоматологического института им. Семашко, Центральной республиканской клинической больницы Минздрава РФ, Международного медицинского консорциума "Мечников". Перечень соавторов, участвовавших в проведении отдельных разделов работы, приведен в списке публикаций. Всем им автор выражает глубокую благодарность.

Особую благодарность автор выражает научным консультантам: академику РАМН профессору Н.К. Пермякову и члену-корреспонденту РАМН профессору А.А. Кубатиеву, а также профессору В.Н. Галанкину, профессору В.М. Бондаренко и профессору В.Г. Лиходеду за радость совместной работы и творческого обсуждения результатов. Автор также искренне благодарит своих коллег и помощников А. Н. Крупника., Р.А. Уразаева, В.А. Анохина, Н.О. Крюкова, И.А. Аниховскую и других сотрудников, соискателей и докторантов лаборатории патанатомии экстремальных состояний НИИ морфологии человека РАМН и Международного медицинского консорциума "Мечников".

Автор планировал этапы проведения исследований, руководил всей работой, принимал непосредственное участие в проведении и оценке результатов исследований.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы традиционные клинические, клинико-лабораторные, морфологические (в том числе секционные), биохимические, иммунохимические, иммуноферментные, микробиологические и статистические методы исследований, а также различные методы работы, с экспериментальными животными.

В различных иммунологических исследованиях были использованы препараты гликолипида Rе-хемотипа, полученные из бактерий штамма Salmonella minhessota Re-595 путем экстракции смесью хлороформа с метанолом и конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином, препараты ЛПС 014 с общим антигеном энтеро6актерий, полученные из бактерий Escherichia coli 014, конъюгаты антител к гликолипиду Re-хемотипа с флюоресцеином или пероксидазой хрена, а также коммерческие препараты протеина А и сыворотки против иммуноглобулинов IgG, IgM и Fав-фрагментов иммуноглобулинов человека. В ряде исследований для выявления антител к Rе-гликолипиду были использованы эритроциты, сенсибилизированные Rе-гликолипидом (получены от А.В. Аполлонина). Использованы также электрофоретический анализ различных препаратов ЛПС по Laemmly (1970) и иммуноблотинг по Нго и Ленхофф (1988). Эндотоксинсвязывающую активность липопротеинов высокой удельной плотности определяли по способу, описанному В.Г. Лиходедом и соавторами (1990). Содержание туморнекротизирующегофактора TNF роценивали по методу Deist и соавторов (1988).

Некоторые другие методы исследований приведены в следующих разделах.

Краткая характеристика материалов и методов исследования представлена в таблице 1.

Таблица 1

Краткая характеристика материала и методов исследования

NN раздела	Вид млекопитающего, нозология, объект исслед.,кол-во (n), [n]	Методики
1	2	3
3.1.1.	Человек, практически здоровый, плазма крови, (n > 200). [32]	микро-ЛАЛ-тест
3.1.2.	Человек, пр.здор., кролик интакт. мазки крови (ПЯЛ), (n >200), [3,6,8,10,11,13,14,15]	светооптич.иммуноморфология (флюоресцентная), ЛПС-тест с верификаций азур-эозином
3.1.3.	Человек, пр.здор. (200), больные менингитом (45), мазки крови, (n>300), [33,36]	светооптич.иммуноморфология (ферметная), ЛПС-тест-ИФА
3.1.4.	Человек, пр.здор. (21), ребенок б-ной ОРВИ (7), новорожденный (13) плазма крови (n>500) [32]	тонкосл. иммуноанализ: ТИА-ан-тиэндотокс; РПГА: Антиэндо-токс-1; дот-блот; иммуноблот.
3.1.5.	Человек, пр.здор. (>1000), плазма крови (n>1000)	иммуноферментный анализ: Антиэндотокс-ИФА
3.1.6.	Человек, пр.здор. (5000), больные разл. хрон. заб-ми (293), плазма крови, (n>5000) [34]	иммуноферментный анализ: СОИС-ИФА. Проф. осмотр, спец. диагностические методы исслед.
3.2.	Человек, беремен. пр.здор. (12), с гестозом (59), новорож. (51), родиль-ца (40), плазма кр. (n=103), [6] мазки крови (ПЯЛ) (n>118) [32]	ЛПС-тест СОИС-ИФА ТИА-антиэндотокс
3.3.	Человек, б-ной прост. аппенди-цитом(7),деструкт аппен. с пери-тонитом (26), разлит. перит. (21), плазма крови (n=141), мазки кро-ви(ПЯЛ) (n=78)отпеч. аппенди-кса (n>100) [11, 20, 22, 25, 37, 38]	ЛПС-тест Антиэндотокс-1 Антиэндотокс-ИФА ЛПС-тест-ИФА TNF-тест (по Deist)
3.4.	Человек, дети пр.здор. (20), дети б-ные ОРВИ с глад.теч., осложнен. БОС или пневмонией (319), плазма крови (n>1000), мазки крови (ПЯЛ) (n>1000) сек. набл. (3) [24, 31, 35]	ЛПС-тест Антиэндотокс-ИФА ЛПС-тест-ИФА Микро-ЛАЛ-тест
3.5.	Человек, больные мочекаменной бол-нью (8), хр.пиелонефр. (8), онкол.моч.пузыря (9), ОПН при перетоните (5), мазки крови (n>100), гист. препар. почки (n=60) секц. набл. (7) [10, 17,]	ЛПС-тест ЛПС-тест-ИФА Рутинная гистология
3.6.	Человек, пр.здоровый, больные разн. заб., мазки крови (n>2000), ПЯЛ секц.наблюд. (7); кролик (n>150) при ГФШ и ЭШ: лекгие ПЯЛ, АМ [7,11-18,23,24,27,31]	ЛПС-тест ЛПС-тест-ИФА Фагоцитарные тесты, электронная микроскопия, рутинная гистология
3.7	Кролик, интакт., при ГФШ и ТКС (n>200), внутренние органы, миокард; гист.срезы (n>10000), моделир.ТКС и ИМ(n=57) [1-4, 9, 19, 26]	Рутинная гистология и гистохимия, гистоэнзимология, поляризационная электрокардиография
3.8	Мыши (n>2000) при ЭШ, срезы внутренних органов: (n>5000) [5,21,28,29,30]	Рутинная гистология, специальные методы исслед.

3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка новых способов диагностики эндотоксинемии и оценки активности антиэндотоксиновоro иммунитета.

Определение возможной роли эндотоксина грамотрицательных бактерий в физиологии и патологии человека недостижимо без разработки новых общедоступных методов выявления ЛПС и оценки активности антиэндотоксиновых систем в организме здоровых и больных людей. Решению этих задач посвящена первая часть экспериментальных и клинических исследований.

3.1.1. Выявление эндотоксина при помощи микромодификации теста с пизатом амебоцитов краба рода Limulus (микро-ЛАЛ-тест).

Наиболее распространенным способом определения ЛПС в жидких средах, в том числе в циркулирующей крови в настоящее время является лимулюс-тест (ЛАЛ-тест), основанный на способности ЛПС вызывать коагуляцию белковых фракций лизата амебоцитов краба Limulus polyphenus. Этот тест характеризуется высокой чувствительностью (выявляет до 0.1 пг ЛПС в 1 мл). К недостаткам метода относятся отсутствие строгой специфичности, необходимость применять строго апирогенные растворы и высокая стоимость (10-15 $ в среднем на один анализ). Последнее обстоятельство побудило нас разработать менее дорогую и не менее чувствительную микромодификацию этого теста (совместно с Р.А. Уразаевым; А.Н, Крупником) [32].

Исходным моментом в этой разработке послужило предположение, что при помощи светового микроскопа можно оценить степень кристаллизации белков лизата амебоцитов, которая зависит от концентрации эндотоксина. Это предположение подтвердилось при изучении взаимодействия лизата амебоцитов с растворами, содержащими различные концентрации ЛПС.

Как видно на рис. 1. дисперсность кристаллической сетки зависит от концентрации ЛПС. При этом степень кристаллизации можно оценить в крестах (от + при 2.5 пг/мл эндотоксина до ++++ при концентрации 20.0 пг/мл эндотоксина).

Процедура постановки теста заключается в следующем: кровь забирают в лабораторную посуду, прогретую 3 часа при 300° С в алюминиевой фольге. Кожу перед взятием крови обрабатывают спиртом и апирогенной водой. В кровь добавляют гепарин (10-15 ед/мл), охлаждают до 4°С и центрифугируют 10 мин. при 1000g. Перед постановкой теста плазму крови разводят апирогенной водой, прогревают 10 мин при 80°С, охлаждают, добавляют равный объем разведенного апирогенной водой лизата амебоцитов и полученную смесь инкубируют 45 мин при З7°С. Степень кристаллизации затем оценивают в мазках под микроскопом и концентрацию ЛПС определяют путем сравнения со стандартными образцами, микрофото которых приведено на рис. 1.

Микро-ЛАЛ-тест является полуколичественным и более экономичным, чем обычный ЛАЛ-тест, так как при его постановке на 1 анализ расходуется в 10 раз меньше реактивов. Чувствительность теста - 2.5 пг/ЛПС в 1 мл сыворотки, разведенной 1: 10.

Рис. 1. Микро-ЛАЛ-тест. Дисперсность кристаллической сетки в зависимости от концентрации ЛПС в среде: А - 0 пг/мл; Б - 2.5 пг/мл; В - 5,0 пг/мл; Г - 10.0 пг/мл; Д - 15.0 пг/мл; Е - 20.0 пг/мл. На участке Е - аморфная масса геля в виде темных пятен, в правом нижнем углу - деструкция сетки и свободные от белка зоны (32).

З.1.2.0бнаружение зндотоксина при взаимодействии ЛПС с граиулоцитами крови (ЛПС-тест).

В основу этого метода положена известная (в опытах in vitro) способность ЛПС взаимодействовать и связываться с полиморфноядерными лейкоцитами (ПЯЛ). Мы полагали (и это нашло подтверждение в экспериментах), что при смешивании пробы, содержащей эндотоксин, ПЯЛ, связавшие ЛПС. могут быть выявлены в тонких мазках крови при обработке мазков флюоресцирующими антителами к Rе-гликолипиду, которые способны распознавать ЛПС различных грамотрицательных бактерий.

Тест осуществляют следующим образом: Пробу, содержащую эндотоксин, смешивают с кровью, выдерживают 30 мин при 37°С, готовят тонкий мазок, фиксируют метанолом или этанолом, отмывают солевым раствором, наносят на мазок неконъюгированную сыворотку или плазму крови неиммунизированного животного (для подавления неспецифического связывания Флюоресцирующих антител), отмывают, наносят флюоресцирующую сыворотку, содержащую антитела к Rе-гликолипиду, выдерживают 30 мин, отмывают и микроскопируют в микроскопе Люмам И 1 с иммерсией. При наличии исследуемой пробе эндотоксина на мазке, видны ярко светящиеся участки, в которых расположены лейкоциты (рис.2). Интенсивность люминесценции условно может быть выражена в крестах.

Рис. 2. Ярко светящаяся клетка (слева) и верификация in situ супераффинных к ЛПС (ЛПС-теста) клеток периферической крови с помощью азур-эозина. Интенсивность люминесценции ++++, х 1200.

Если мазок предварительно обработать неконъюгированными антителами к Rе-гликолипиду, а затем флюоресцирующими антителами к гликолипиду, то светящиеся участки отсутствуют, что указывает на специфичность реакции флюоресцирующих анти- Re антител. Чувствительность метода - около 1 пг ЛПС в 1 мл исследуемой пробы. К недостаткам метода следует отнести необходимость работы с УФ микроскопом и микроскопирование мазка сразу после обработки флюоресцирующими антителами, так как интенсивность свечения со временем заметно снижается.

3.1.3. Способ оценки эндотоксинемии и антиэндотоксинового иммунитета по эндотоксиносвязывaющей активности лейкоцитов крови.

Недостатки ЛПС-тест с флюоресцирующими антителами побудили нас видоизменить тест, использовать вместо флуоресцирующих антител антитела к Rе-гликолипиду, конъюгированные с пероксидазой хрена. Так была разработана иммуноферментная модификация теста - ЛПС - тест - ИФА.

В первых же экспериментах по отработке этого теста была выявлена очень интересная закономерность - в мазках крови здоровых животных и людей без смешивания их крови с пробой, содержащей эндотоксин, обнаруживались ПЯЛ, несущие на своей поверхности ЛПС, который выявляется при помощи конъюгированных с ферментом антител к Rе-гликолипиду. Поэтому в дальнейшем мы использовали этот метод для выявления эндотоксина в крови обследуемых.

Кроме того, было установлено, что, если перед обработкой конъюгированными антителами на мазки нанести раствор ЛПС, а уж затем конъюгированные антитела, то количество клеток, несущих ЛПС, увеличивается. В такой модификации метод позволяет определить содержание клеток, связавших эндотоксин in vivo (в организме обследуемого) и содержание клеток, способных дополнительно связывать ЛПС in vitro при обработке мазка раствором ЛПС. Иными словами, метод позволяет оценивать так называемые резервы связывания эндотоксина.

В кратком изложении способ осуществляют следующим образом. У обследуемого берут кровь, готовят два тонких мазка, подсушивают и фиксируют метанолом или этанолом. Для инактивации эндогенной пероксидазы на мазки наносят смесь этанола с 3% перекисью водорода. После отмывания для выявления клеток, способных связывать эндотоксин in vitro, на один из мазков наносят на 30 мин. 1 мл раствора Rе-rликолипида в концентрации 40 мкг/мл. Вслед за отмыванием оба мазка в течение 30 мин. обрабатывают конъюгатом антител к Rе-гликолипиду с пероксидазой, отмывают и на 30 мин. наносят субстрат фермента с красителем, затем снова отмывают, и для выявления ядер клеток мазок окрашивают толуидиновым синим или другим красителем (например: азур-эозином и др. ) для верификации клеток, связавших эндотоксин. При микроскопировании в мазках хорошо видны клетки, несущие на своей поверхности эндотоксин и связавшие конъюгат антител с пероксидазой (рис.3).

Рис. 3. ЛПС-позитивный гранулоцит с дискретно расположенной на поверхности ферментной меткой (справа).

Лейкоцит без ферментной метки (слева). ЛПС-тест-ИФА. х 2000

Эти клетки окрашены в желтоватый цвет. В клетках видны также ядра, окрашенные в синий цвет. При этом в мазке (без нагрузки ЛПС) определяются только ПЯЛ, связавшие эндотоксин in vivo.

Для определения показателей нормы, обследовали 35 здоровых лиц в возрасте 25-50 лет. В среднем было обнаружено 3,5 + 0,4% лейкоцитов, связавших эндотоксин iп vivо, и 8,4 + 0,6% ПЯЛ, несущих ЛПС после обработки мазков эндотоксином iп vitro. При этом предварительная обработка мазков антителами к Rе-гликолипиду, не конъюгированными с .ферментом, снижала количество ЛПС-позитивных ПЯЛ, выявленных при помощи способа ЛПС-тест-ИФА. После сорбции антител к Re-гликолипиду из неконъюгированной сыворотки она утрачивала способность снижать количество ЛПС-позитивных гранулоцитов. Следовательно, ЛПС-тест-ИФА специфически выявляет лейкоциты, несущие ЛПС.

Таким образом, было установлено, что здоровые люди характеризуются наличием умеренной, по-видимому, физиологической СЭЕ (З,5 + 0,4% ЛПС-позитивных ПЯЛ). Кроме того, 4,9% (8,4-3,5%) лейкоцитов способны связывать ЛПС дополнительно, т.е. при обработке мазков iп vitro.

Мы полагали, что значительно большее количество ЛПС-позитивных ПЯЛ можно выявить при инфекционных заболеваниях, вызванных грамотрицательными бактериями, например, у больных бактериальными менингитами в начале заболевания, когда в циркулирующей крови при помощи ЛАЛ-теста всегда обнаруживается эндотоксин. К нашему удивлению при изучении 45 больных менингитом были получены противоположные результаты: при поступлении в клинику содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов, связавших ЛПС in vivo и in vitro было крайне низким (0,1 + 0,03% и 0,1 + 0,04% соответственно). При выписке содержание таких гранулоцитов увеличивалось до 6,8 + 0.9% и 8,1 + 0.5% соответственно. Эти данные позволили предположить, что содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ может отражать не только наличие эндотоксинемии, но и состояние антиэндотоксинового иммунитета.

Приведенные материалы обусловили необходимость изучения механизмов связывания эндотоксина in vivo и in vitro. В связи с этим мазки от здоровых людей обрабатывали сначала сыворотками против IgG, IgM и Fаb фрагментов иммуноглобулинов человека, а затем по способу ЛПС-тест-ИФА. Все эти сыворотки предварительно сорбировали, чтобы удалить антитела к Rе-гликолипиду. Полученные результаты показали, что сыворотки против IgM не влияли на количество ЛПС-позитивных ПЯЛ, связывающих эндотоксин и in vivo и in vitro. в то же время сыворотки против IgG и особенно сыворотки против Fab фрагментов иммуноглобулинов значимо снижали количество гранулоцитов, связавших ЛПС in vivo и количество лейкоцитов, связывающих эндотоксин in vitro. Установлено также, что сыворотка к Re-гликолипиду, не конъюгированная с ферментом, резко снижала количество ПЯЛ, связавших ЛПС in vivo, однако, если такой мазок перед добавлением анти-Rе-конъюгата обрабатывалась Rе-гликолипидом, то количество ЛПС-позитивных лейкоцитов восстанавливалось до нормы.

Эти данные показали, что гранулоциты in vivo и in vitrо связывают эндотоксин при помощи Fc-опосредованного механизма, за счет антител класса IgG, фиксированных на поверхностных Fс-рецепторах лейкоцитов. В связи с этим можно полагать, что содержание ПЯЛ, связавших ЛПС in vivo, и лейкоцитов, способных связать эндотоксин in vitro зависит от степени эндотоксинемии, от наличия на гранулоцитах Fс-рецепторов и связанных с ними антиэндотоксиновых антител класса IgG, т.е. от степени армированности лейкоцитов IgG-антителами. Все это позволяет сделать заключение о защитном характере Fс-зависимого связывания ЛПС гранулоцитами.

Для удобства описания состояний, выявляемых при помощи ЛПС-теста-ИФА, мы применяли следующие условные обозначения:

→ нормальное содержание ЛПС-позитивных гранулоцитов в циркулирующем кровотоке;

↑ повышенное содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов в организме обследуемого;

↓ сниженное содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ в организме обследуемого;

+ наличие лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин при нагрузке ЛПС Rе-хемотипом in vitro;

- отсутствие ПЯЛ, способных дополнительно связывать эндотоксин при нагрузке гликолипидом in vitro.

Обследование больших групп экспериментальных животных и людей показало, что по состоянию антиэндотоксинового иммунитета, оцениваемого при помощи способа ЛПС-тест-ИФА, они могут быть разделены на 6 групп:

Группа 1 (→ +) - характеризуется нормальным содержанием, ЛПС-позитивных лейкоцитов in vivo и наличием ПЯЛ, способных связывать эндотоксин in vitro;

Группа II (↑ +) - повышенное содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов in vitro и наличие гранулоцитов, способных связывать эндотоксин in vitro (группа характеризуется активацией анrиэндотоксинового иммунитетана на фоне компенсированной эндотоксинемии);

Группа III (↑ -) - повышенное содержание эндотоксин-позитивных лейкоцитов in vivо и отсутствие клеток, способных связывать ПЯЛ -in vitro (активация антиэндотоксинового иммунитета на фоне декомпенсированной эндотоксинемии; вследствие того, что антиэндотоксиновый иммунитет не в состоянии полностью компенсировать эндотоксинемию, начинается истощение антиэндотоксинового иммунитета);

Группа IV(→ -) – содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов in vivo находится в пределах нормы, однако резервы дополнительного связывания эндотоксина истощены, т.е. имеет место выраженное истощение, антиэндотоксинового иммунитета;

Группа V (↑ -) - низкое содержание эндотоксин-позитивныХ ПЯЛ in vivo и отсутствие резервов для дополнительного связывания ЛПС in vitro (резкое угнетение антиэндотоксинового иммунитета);

Группа VI (↓ +) - сниженное содержание ЛПС-позитивных гранулоцитов in vivo, однако имеются лейкоциты, способные связывать ЛПС in vitrо (восстановление угнетенного ранее антиэндотоксинового иммунитета).

Схематически эти состояния можно представить следующим образом:

активация иммунитета активация иммунитета

на фоне компенсир. СЭЕ на фоне декомпенсир. СЭЕ

Рис.4. Динамика изменения показателей СЭЕ и анrиэндотоксинового иммунитета по результатам ЛПС-тест-ИФА.

Метод ЛПС-тест-ИФА был использован нами в предварительных исследованиях для оценки состояния антиэндотоксинового иммунитета у лиц, проживающих в районах с повышенным загрязнением радионуклидами: Обследовано 100 таких лиц, а также 100 практически здоровых людей, проживающих в г.Москве. В каждую группу были включены лица обоих полов в возрасте 18-45 лет. По содержанию ЛПС-позитивных ПЯЛ они были разделены на 6 описанных групп (табл.2).

Таблица 2

Состояние антиэндотоксинового иммунитета у лиц в

загрезненных радионуклидами в районах и в г.Москве.

Группы	Состояние иммунитета	Количество лиц
		в загрезненных районах	в Москве
1 2 3 4 5 6	→ + ↑ + ↑ - → - ↓ - ↓ +	9 18 37 8 16 12	66 12 10 9 2 1
Общее кол-во лиц в группах 3, 4, 5		61	21
Общее кол-во лиц в группах 1, 2, 6		39	79

Как видно из табл. 2, в зоне с повышенным содержанием радионуклидов большинство обследованных (61%) относится к группам 3, 4, 5, которые характеризуются наличием декомпенсированной эндотоксинемии и угнетением антиэндотоксинового иммунитета. В то же время в Москве к таким группам было отнесено лишь 20% обследованных. При анализе анамнестических данных и дополнительных обследованиях у лиц, отнесенных к группам 3, 4, 5 в 70% случаев обнаружены острые и хронические заболевания органов дыхания, пищеварения, выделительной системы, дисбактериоз. Следовательно, иммуноферментная тест-система ЛПС-тест-ИФА может быть использована при диспансеризации и оценке состояния здоровья людей, в т. ч. облученных.

З.l.4. Определение титров антиэндотоксиновых антител при помощи диагностической тест-системы "ТИА-антиэндотокс".

. В ряде экспериментов для определения титров антител, связывающих эндотоксин, мы использовали диагностическую тест-систему "Антиэндотокс-1", разработанную В. Г. Лиходедом и соавторами (1983). Эта система представляет собой формалинизированные и таниназированные бараньи эритроциты, сенсибилизированные гликолипидом Rе-хемотипа в комплексе с бычьим сывороточным альбумином. Система хорошо работает в РПГА, например при отборе высокотитражных образцов плазмы крови доноров, однако применение ее для обследования больных с острой патологией бывает затруднительно из-за возможности ложнопозитивных неспецифических реакций за счет белков острой фазы. В связи с этим, мы разработали (совместно с Р.А.Уразаевым, А.Н.Крупником) [32] новую диагностическую тест-систему "ТИА-антиэндотокс", которая основана на определении титров антител к Rе-гликолипиду методом тонкослойного иммунного анализа. Для постановки реакции полистироловые чашки Петри сенсибилизировали раствором Rе-гликолипида. а затем свободные участки на полистироле насыщали бычьим сывороточным альбумином и заливали 1% агаром Дифко. На поверхность агара наносили образцы исследуемых сывороток и через 16-18 часов оценивали зоны преципитации, которые становились хорошо заметными после кратковременного выдерживания чашек над горячим паром (рис.5).

Титр анти-Rе-антител можно при этом оценивать путем нанесения на агар различных разведений сыворотки (или плазмы) или путем измерения диаметра зоны преципитата при нанесении цельной сыворотки:

диаметр зоны титр сыворотки

0.9 мм 1:2

до 1.9 мм 1:4

до 2,8 мм 1:8

до 3.9 мм 1: 16

до 4.9 мм 1:32

до 5.9 мм 1:64

до 6.9 мм 1:128

до 7. 9 мм 1: 256 .

При сравнительном обследовании тест-система "ТИА-антиэндотокс" по чувствительности в несколько раз превышала РПГА с эритроцитарным диагностикумом «Антиэндотокс-1», но на 1-2 порядка уступала чувствительности иммуноферментной тест-системы «Антиэндотокс-ИФА».

Рис. 5. Зоны специфической конденсации паров при проведении тонкослойного иммуноанализа (ТИА-антиэндотокс). Величина диаметра прямо

соответствует титру антител.

3.1.5. Выявление антиэндотоксиновых антител при помощи иммуноферментной тест-системы "Антиэндотокс-ИФА".

С целью повышения чувствительности способа определения титров антител к гликолипиду, Rе-хемотипа мы разработали иммуноферментную диагностическую тест-систему «Антиэндотокс-ИФА" (совместно с Р.А.Уразаевым, А.Н.Крупником). Для этого.полистироловые планшеты для иммунологических реакций сенсибилизировали раствором Rе-гликолипида, затем в лунки вносили по 250 мкг буфера для разведения и по 16 мкг исследуемой сыворотки или плазмы крови. После инкубирования и промывания в лунки вносили 150 мкг протеина А, конъюгированного с пероксидазой хрена, инкубировали, промывали, добавляли субстрат с красителем и содержание антител определяли по показателю экстинции при длине волны 405 нм. При каждом определении в качестве контроля (нормы) использовали пул плазмы крови от 43 здоровых доноров. Способ позволяет выявлять антитела к Rе-гликолипиду класса IgG, c которыми связывается протеин А..

3.1.6. Оценка антиэндотоксинового иммунитета при помощи диагностической тест-системы "СОИС-ИФА".

Основанием для разработки этой системы послужили отдельные наблюдения того, что оценка иммунного статуса является более полной при одновременном определении титров антител к Re-гликолипиду и антигену ЛПС 014 с общим антигеном энтеробактерий. В связи с этим мы создали способ оценки иммунного статуса, основанный на применении иммуноферментной тест-системы "СОИС-ИФА" [34]. Для этого определяют содержание антител к Rе-гликолипиду при помощи тест-системы "Антиэндотокс-ИФА" и содержание антител к ЛПС 014 и общему антигену энтеробактерий. В последнем случае полистироловые планшеты для иммунологических исследований сенсибилизируют антигеном, выделенным из клеток Escherichia coli 014 (получен от В. М.Бондаренко), а все последующие операции проводят как при использовании системы «Антиэндотокс-ИФА".

При этом определяют показатель Е1, характеризующий содержание IgG-антител к Rе-гликолипиду, и показатель Е2, характеризующий содержание IgG-антител к антигену ЛПС014 и общему антигену энтеробактерий, а также показатель

П = Е2 / Е1,

определяющий отношение показателя Е2 к показателю Е1. В качестве нормы в каждом исследовании определяют показатели Е1, Е2 и П для пула образцов плазмы от 43 здоровых доноров. Отклонением от нормы считали увеличение или уменьшение показателей не менее чем на 2 сигмы.

С целью апробации метода СОИС-ИФА было проведено обследование 293 практически здоровых людей (рабочих и служащих производственного объединения "ТАСМА" в Г.Казани) - полученные результаты позволили разделить обследованных на 11 групп следующим образом (табл.3).

Для контроля объективности обследования целенаправленно привлекались следующие специалисты: терапевт, кардиолог, пульмонолог, акушер-гинеколог, гастроэнтеролог, окулист, невропатолог. По показаниям проводились ультразвуковое исследование, гастрофиброскопия, ЭКГ. Проведено 227 анализов на раково-эмбриональный антиген, антиген рака молочной железы, альфа-фетопротеин, углеводный антиген злокачественных опухолей панкреато-гепато-дуоденальной области, кислую фосфатазу предстательной железы, бета-2-микроглобулин, ХГЧ, ЛГ, ФСГ, эстрадиол, прогестерон, тестостерон, ТТГ, тироксин, трийодтиронин, кортизол. 23 человека дообследовались в стационарных условиях. Больные с острыми заболеваниями в состав обследованных не входили. Результаты обследования специалистами представлены в табл.3.

Таблица 3

Показатели антител к Re-гликолипиду (Е1), ЛПС с общим антигеном энтеробактерий (Е2) и их соотношение (П) у сотрудников ПО «ТАСМА»

Группы обследованных	Количество обследованных	Показатели
		Е1	Е2	П
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11	34 10 20 22 29 63 4 18 30 17 46	→ ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ → ↓ ↑ →	→ ↓ ↓ ↑ ↑ ↑ ↓ ↓ → → ↑	→ → ↑↓ → ↑↓ ↑ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑
Всего 293

Обозначения: → норма, ↓ ниже нормы, ↑ выше нормы

Таблица 4

Частота выявления диспансерных больных в группах «СОИС-ИФА» (в %)

№ группы	Число обследован.	Нозологическая форма
		Фибро-миомы	Язвен. б-нь	Узлов. зоб и узлов. масто- патия	Пиело- нефрит	Хрон. пнев- мония	Ревма- тизм	Кисты и по- липы разл. орг.	Зло- кач. ново- образ.
1	34	-	-	2,9	-	-	-	-	-
2	10	10,0	-	-	10,0	-	-	-	-
3	20	15,0	15,0	-	20,0	-	10,0	30,0	-
4	22	4,5	-	9,0	13,6	-	-	13,6	-
5	29	17,2	13,8	10,3	20,7	3,4	3,4	6,9	3,4
6	63	19,0	3,2	7,2	15,9	4,8	4,8	11,6	1,4
7	4	-	-	-	-	-	-	-	-
8	18	16,7	11,1	-	5,6	-	-	22,2	5,6
9	30	6,7	6,7	-	10,0	3,3	3,3	-	-
10	17	35,3	11,8	13,0	11,8	-	-	11,8	-
11	46	2,2	4,3	4,3	8,7	-	-	2,1	-
Всего 293

Как видно из табл. 4, различные хронические заболевания (диспансерные больные) наиболее часто выявляются в группах З, 5, 6, 8, 10, которые можно отнести к группам риска.

Состояние резистентности организма по результатам обследования при помощи тест-системы "СОИС-ИФА" в группах можно оценить следующим образом: при нормальных значениях Е1, Е2 и П состояние резистентности оценивают как нормальное (1-я группа); при снижении Е1 и Е2 и нормальном значении П - как физиологический вариант нормы (2-ая группа); при снижении Е1 и Е2 и снижении или повышении П - как вариант угнетения резистентности (3-ья группа); при повышении Е1 и Е2 и, нормальном значении П - как вариант физиологической активации резистентности (4-ая группа); при повышении Е1 и Е2 и повышении или снижении П - как вариант дисбалансированной активации резистентности (5-ая группа); при снижении Е1, повышении Е2 и П - как вариант активации селективно сниженной резистентности (6-я группа); при повышении Е1, снижении Е2 и П как вариант дисбалансированной активации селективно сниженной резистентности (7-ая группа); при нормальном значении Е1, снижении Е2 и П - как вариант декомпенсированного снижения резистентности (8-я группа); при снижении Е2, нормальном значении Е2 и повышении П - как вариант компенсированного снижения резистентности (9-ая группа); при повышении Еl, нормальном значении Е2 и снижении П - как вариант декомпенсированной активации сниженной резистентности (10-я группа); при нормальном значении Е1, повышении Е2 и П - как вариант компенсированной активации измененной резистентности (11-ая группа). Предлагаемый способ применялся при обследовании более чем 5 000 рабочих и служащих ВИАМ и завода низковольтной аппаратуры (г.Москва), производственного объединения "Тасма" (г.Казань), Шевченковского завода пластических масс (г.Актау) и ряда других предприятий СНГ. Способ позволил выявить "группы риска", латентно протекающие формы болезни, состояния предболезни. Способ не требует дорогостоящего оборудования, прост в исполнении, позволяет повысить эффективность профилактики и лечения, сократить потери по временной нетрудоспособности.

Вместе с тем необходимо отметить, что для разностороннего теоретического объяснения результатов, получаемых способом "СОИС-ИФА", при сопоставлении частот патологических процессов в выявленных группах резистентности организма с показателями титров антител, необходимы дальнейшие исследования. В частности, следует сопоставить результаты одновременного обследования разных групп населения, здоровых и больных при помощи системы ЛПС-тест-ИФА и "СОИС-ИФА". Эти исследования пока не проведены в связи с более поздней разработкой системы ЛПС-тест-ИФА.

3.2. Эндотоксинемия и антиэндотоксиновый иммунитет у беременных женщин и новорожденных.

В своих исследованиях мы прежде всего попытались оценить возможную роль эндотоксина в период беременности, в частности, роль эндотоксина при поздних токсикозах беременности. Первые данные, свидетельствующие об участии ЛПС в патогенезе поздних гестозов, были нами опубликованы в 1987 году. У 48 из 59 женщин в мазках периферической крови определялись ПЯЛ, перегруженные ЛПС. Последующие исследования (проведенные в нашей лаборатории Д.В.Добронецкой), осуществленные при помощи микро-ЛАЛ-теста и ТИА-антиэндотокса, показали, что при гестозах беременность и послеродовый период протекают на фоне повышенного по сравнению с контролем (беременные без токсикоза) содержания эндотоксина в крови и сниженного содержания антиэндотоксиновых антител. Эти данные подтверждают участие СЭЕ патогенезе этой патологии.

Далее было изучено содержание эндотоксина в плазме и титры антиэндотоксиновых антител у матерей и новорожденных спустя 1 сутки после родов. Они были разделены на группы в зависимости от состояния новорожденных: здоровые дети (группа1) и их матери (группа 4); дети с физиологическими реакциями адаптации (группа2) и их матери (группа 5), дети с патологическими реакциями адаптации (группа 3) и их матери (группа 6).

Как видно из таблицы 5, в контрольных (здоровых) группах детей (группа 1) содержание эндотоксина в плазме крови было значительно меньше, чем у детей с физиологическими (группа 2) и патологическими (группа 3) реакциями адаптации. Патологические реакции адаптации протекают на фоне снижения титра, антиэндотоксиновых антител (группа 3). Необходимо отметить, что у детей группы 3 с уменьшением патологических реакций адаптации снижалось содержание эндотоксина в плазме и к моменту выписки домой (14 дней после родов в среднем) нарастали титры анти тел к Re-гликолипиду.

Можно полагать, что эндотоксин является одной из возможных патофизиологических причин развития реакции адаптации. Кроме того, необходимо отметить наличие СЭЕ у новорожденных вскоре после рождения, что может быть следствием колонизации организма грамотрицательной микрофлорой

Таблица 5

Содержание эндотоксина и антиэндотоксиновых антител в плазме крови новорожденных и их матерей [32]

Обследованные	Группа	Количество обследованных	Содержание ЛПС (пг/мл)	Обратные титры антител к Re-гликолипиду
Дети	1 2 3	26 13 22	1.2+0.4 *6.0+1.5 *8.2+1.2	22.9+3.1 *60.3+10.1 10.2 + 2.3
Матери	4 5 6	21 8 11	2.4+0.9 ***1.3+0.5 6.8 +1.9	16.4+2.6 **96.0+26.4 47.3+14.9

* - Р<0.05 по отношению к 1-ой группе

** - Р<0,05 по отношению к 4-ой группе

*** - Р<0;05 по отношению к 6-ой группе

Следует отметить, что и в более позднем периоде у детей имеет место СЭЕ, по-видимому, физиологическая, и в плазме крови содержатся антиэндотоксиновые антитела. При изучении здоровых 20 детей в возрасте от 1,5 до 3 лет были определены следующие показатели:

Содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов 4.2 + 1.15%

Содержание эндотоксинав в плазме 1.36 + 0.61 пг/мл

Обратные титры антител к Rе-гликолипиду 16.8 + 3.39.

Эти данные позволяют заключить, что эндотоксин антиэндотоксиновый иммунитет играет важную роль в физиологии и патологии беременных женщин и новорожденных.

3.3. Эндотоксин и эндотоксинсвязывающие системы при аппендиците и разлитом перитоните.

Первые результаты, свидетельствующие об участии ЛПС в патогенезе аппендицита, были опубликованы, нами в 1989. Они были получены с помощью ЛПС-теста (реакция считалась положительной при наличии ЛПС-перегруженных ПЯЛ с интенсивностью люминесценции +++, ++++). Так, при остром неосложненном аппендиците эндотоксин-перегруженные гранулоциты определялись в 16.6%, а при остром деструктивном - в 87.5% наблюдений. Наличие ЛПС-гиперактивированных ПЯЛ в периферической крови у больных с острым неосложненным аппендицитом при отсутствии четко выpаженных морфологических признаков воспаления отростка может свидетельствовать в пользу того, что СЭЕ предшествует лейкоцитарной инфильтрации тканей аппендикса и его деструктивным изменениям. Способность ЛЩ-перегруженных гранулоцитов проявлять аутоагрессивные свойства (см. 3, 6.), присутствие ЛПС в кишечнике и наличие разнообразных факторов, способных быть причиной повреждения слизистой аппендикса и развития СЭЕ, позволило нам предположить, что патогенез острого аппендицита аналогичен местному феномену Шварцмана. В пользу этого предложения свидетельствовало наличие в отпечатках флегмонозно-измененного аппендикса ЛПС-перегруженных гранулоцитов (рис.6).

Рис.6. ЛПС-перегруженный гранулоцит в отпечатке аппендикса при флегмонозном воспалении. х 2000 ЛПС-тест-ИФА.

Для оценки роли эндотоксина при разлитом перитоните в крови больных определялось содержание туморнекротизирующего фактора (ТNF), который, как известно, является основным медиатором токсического действия ЛПС. Исследован 21 больной: 15 выздоровевших (1-ая гр.) и 6 умерших (2-ая гр.). Результаты исследования приведены в таблице 6.

Из таблицы 6 следует, что в первые сутки послеоперационного периода концентрация, TNF в группах сравнения была одинаковой. К 5 суткам содержание TNF у выздоровевших больных, в отличие от умерших, снижается (Р<0,001), что свидетельствует о важной роли ЛПС в патогенезе заболевания и возможности использования показателей содержания TNF в прогностических целях.

Таблица 6

Концентрация ТNF в крови у больных разлитым перитонитом.

Группа	Концентрация в ед/мл (М±m)
	Срок исследования (в днях)
	1	3	5
1-ая (n=15)	82,3±6,3	74,4±5,1	* ** 32,3±4,8
2-ая (n=6)	85,6±7,7		92,0±8,3

Примечание:

n - число обследованных

* - Р<0,001 - к исходному уровню;

** -Р<0,001 - к умершим.

Исследования перитонеального экссудата (В.В.Струсов и соавт.1993) обнаружившие параллелизм между концентрацией TNF в крови и в брюшной полости свидетельствуют о том, что основным продуцентом токсического фактора при разлитом перитоните являются перитонеальные макрофаги, подлежащие удалению из брюшной полости.

Прямое определение ЛПС при помощи ЛАЛ-теста показало. что у 70 больных разлитым перитонитом концентрация эндотоксина в крови при перитонитах значительно повышена и колеблется в пределах от 7,8 ± 3,3 ед.опт.пл. до 14.6 ± 4.8 ед.опт.пл. После проведения экстракорпоральной детоксикации, дающей хороший терапевтический эффект содержание ЛПС снижалось в разных группах больных до 4.9 ± 0.8 и 6.4± 1.4 ед.опт.пл.

Исходя из важной роли ЛПС в патогенезе разлитого перитонита была изучена возможность лечения больных плазмой крови с высоким содержанием антител к Re-гликолипиду. Результаты представлены в таблицах 7 и 8.

Больным 1 группы вводили обычную плазму крови доноров, а больным 2 группы - плазму с высоким (титры 1: 64 - 1: 256) содержанием антител к Rе-гликолипиду (титры определяли в РПГА при помощи эритроцитарного .диагностикума "АНТИЭНДОТОКС-1"). Больные перитонитом при поступлении в клинику характеризовались резко сниженным гуморальным антиэндотоксиновым иммунитетом. Титры антиэндотоксиновых антител начинали возрастать через 5-7 суток после операции и при лечении плазмой крови с повышенным содержанием антител к Rе-гликолипиду. Титры таких антител во 2 группе к 10-15 суткам после операции возрастали до значений нормы. Применение антиэндотоксиновой плазмы крови доноров снижало частоту осложнений после операции и уменьшало продолжительность пребывания больных в клинике (табл.7).

Положительная динамика антиэндотоксиновых антител, регистрируемых методом СОИС-ИФА, наблюдалась также при благоприятном течение перитонита в связи с гангреной тонкой кишки (табл.8).

Таблица 7

Характеристика больных острым аппендицитом, осложненным распространенным перитонитом

№		1 гр.n =14	2 гр. п=12
1	а) гангренозный б) гангренозно-перфоративный	6 8	4 8
2	Xap-p флоры брюшной полости: а) кишечная палочка + протей б) синегнойная палочка в) признаки анаэроб. флоры	13 + 1 = 14 - 4	10 + 1 = 11 1 5
3	Летальность	1	-
4	Послеопер. осложнения: а) инфильтраты брюш. полости б) абсцессы брюшной полости в) эвентрации г) нагноение раны	7 2 1 6	3 1 - 3
5	Койко-дни (средние показат. )	31,2	26,7

Таблица 8

Титры антител к Re-гликолипиду у больных перитонитом

Время обследования	Обратные титры антител
	1 группа	2 группа
При поступлении 1-3 сутки после операции 5-7 сутки после операции 10-15 сутки после операции	2.5 + 0,1 Р1<0,01 2.7+ 0;3 Р1<0,01 4.1+ 0.3 Р1<0,01 9,0.+ 0.9 Р1<0,05	2,7 + 0,2 Р1<0,01 2,3 + 0.2 Р1<0;01 8.8 + 0,6 Р1<0,01 18.3 + 2,2 Р2<0,05
Показатели нормы	19,5 + 0,4

Примечание: Р1 - значимость различий по сравнению с нормой;

Р2 - значимость различий между группами.

В то же время у больных, умерших от перитонита, показатели титров антител к Rе-гликолипиду оставались на крайне низком уровне. Так, по данным СОИС-ИФА у 11 человек, выздоровевших от перитонита, содержание антител к Rе-гликолипиду было повышенным, в то время как у 8 погибших от перитонита содержание таких антител было крайне низким (рис. 8). Эти данные достаточно убедительно свидетельствуют о важной протективной роли антиэндотоксиновых антител при перитонитах.

Рис.7. Динамика показателей содержания IgG-антител против Rе-гликолипида (а) и E.col1 (б) в плазме крови (в ед.опт.плот) в остромпериоде гангрены тонкой кишки с перитонитом. Исход болезни выздоровление. Столбики: средние показатели у здоровых. СОИС-ИФА.

Рис.8.Величина экстинции IgG К Rе-гликолипиду у выздоровевших

(-○--) и умерших (--●--) больных перитонитом. СОИС-ИФА.

В своем большинстве, изученные нами случаи перитонитов развивались как осложнения аппендицита.

Совокупность полученных нами результатов позволяет сделать заключение, что эндотоксин непосредственно вовлекается в патогенез перитонита и обусловливает в значительной мере тяжесть его клинического течения, в то время как антиэндотоксиновые антитела играют важную защитную роль при этой патологии.

3.4. Эндотоксинемия и антиэндотоксиновый иммунитет при патологии легких.

Анализ материалов литературы, включающей экспериментальные и клинические наблюдения, позволил предположить возможность участия эндотоксина в различных видах патологии легких. В этом плане вызывал интерес бронхообструктивный синдром (БОС) при острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ), в частности у детей. Мы обследовали 44 ребенка в возрасте от 4 месяцев до 10 лет, больных ОРВИ.У 20 детей ОРВИ была осложнена БОС, у остальных наблюдалось гладкое течение ОРВИ. Было изучено содержание антиэндотоксиновых антител методом ТИА-антиэндотокс, содержание эндотоксина в плазме микро-ЛАЛ-тестом и содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ, выявленных способом ЛПС-тест и ЛПС-тест-ИФА (совместно с В. А. Анохиным, Р. А. Уразаевым и др.).

Из табл. 9 видно, что у больных детей титр антиэндотоксиновых антител в начале заболевания несколько снижен. При осложненных формах ОРВИ наблюдается медленное нарастание титров по мере выздоровления. Более информативны данные о содержании плазменного и клеточно-связанного ЛПС (табл. 10). У всех больных ОРВИ показатели количества ЛПС-позитивных лейкоцитов и содержания эндотоксина в плазме оказались значительно более высокими, чем у здоровых детей. Особенно высокими были показатели содержания ЛПС-позитивных ПЯЛ. Наибольшее содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов у больных ОРВИ, осложненной БОС, было отмечено в первые 5 дней заболевания, в это же время было отмечено наименьшее содержание эндотоксина в плазме крови.

В первые 5 дней заболевания у больных с БОС была наиболее клинически выражена интоксикация и наблюдалась корреляция между тяжестью заболевания с БОС и содержанием ЛПС-позитивных ПЯЛ.

Были обследованы также дети, у которых ОРВИ осложнялась пневмонией. Средние показатели у таких больных по сравнению с группой больных без пневмонии представлены в таблице 11-13.

Таблица 9

Содержание антител к Re-гликолипиду у детей с ОРВИ, осложненной и неосложненной БОС (n = 101)

Дни заболевания	log2 обратного титра антител к Rе-гликолипиду
	ОРВИ без БОС	ОРВИ с БОС
1 – 3 4 – 5 6 – 10 Позднее 10	2,87 + 0.43 3,37 + 0,47 2,87 + 0,31 3,14 + 0,58	2.50 + 0,66 2,61 + 0.56 2,87 + 0,35 3,62 + 0.58
Здоровые дети(20)	6.55 + 0,28

Таблица 10

Показатели СЭЕ при ОРВИ у детей раннего возраста (n=101)

Дни забо левания	Содержание эндотоксина в плазме (пг/мл)		Содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ (B %),
	ОРВИ без БОС	ОРВИ с БОС	ОРВИ без БОС	ОРВИ с БОС
1 - 3 4 – 5 6 – 10 позднее 10	8.75 + 2.05 8.21 + 1.85 7.66 + 1.35 10.09 + 1.61	2.52 + 1.61 1.82 + 0.72 3.09 + 1.47 5.83 + 2.38	12.90 + 5.16 11.50 + 3.45 9.26 + 2.16 8,00 + 1.98	34.42 + 8.42 25.15 + 6.29 13.94 + 4.39 13.71 + 4.72
Здоровые дети (20)	1.36 + 0.61		4.20 + 1.15

Таблица 11

Титры антиэндотоксиновых антител у больных ОРВИ детей с пневмонией и без пневмонии (n=218)

Дни заболевания	log2 обратных титров антител к Rе-гликолипиду
	ОРВИ без осложнения	ОРВИ с Пневмонией
1 – 3 4 – 5 6 – 10 позднее10	2.78 + 0.28 2,48 + 0.40 2.99 + 0.21 3.26 + 0.41	3,20 + 0.73 2,00 + 0.43 2.61 + 0,30 2,11 + 0.43
3доровые дети	3,55+ 0.28

Из табл.11 видно, что титры антиэндотоксиновых антител у больных ОРВИ особенно у больных с пневмонией были крайне низкими. Содержание эндотоксина в плазме в первые 5 дней заболевания было более высоким у больных с пневмонией, а содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов у них бы-ло более высоким и после 10-го для заболевания (табл.12).

Нужно заметить, что у всех больных показатели плазменной СЭЕ и содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ были более высокими, чем у здоровых детей. Обращает на себя внимани также тот факт, что клинические проявления интоксикации у тяжелых больных ОРВИ с пневмонией коррелируют с концентрацией эндотоксина в плазме крови (табл. 13).

Таблица 12

Содержание эндотоксина и ЛПС-позитивных лейкоцитов при ОРВИ с пневмонией (n=218)

Дни болезни	Содержание эндотоксина в плазме (пг/мл)		Содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ (в%)
	ОРВИ без пневмонии	ОРВИ с пневмонией	ОРВИ без пневмонии	ОРВИ с пневмонией
1 – 3 4 – 5 6 – 10 Позднее 10	6.3+ 1.34 6.9 + 1.36 7.18 +1.00 10.05 +1.38	10.651+ 2.38 12.04+2.89 6.85+ 2.16 3.76 + 1.22	12.74+ 3.26 13.91+ 2.78 11.43+ 2.13 6.42+ 2.19	4.48+ 2.26 13.27+ 3.92 16.83+4.85 11.18+ 3.07
Здоров.дети	1.36+ 0.61		4.2+ 1.15

Таблица 13

Содержание плазменного эндотоксина у детей, больных ОРВИ с пневмонией (n=38)

Наличие интоксикации	Концентрация эндотоксина плазме крови. пг/мл
Отсутствие Выраженная интоксикация	4.24 + 1.22 13.34 + 2.22
Здоровые дети	1.36 + 0.61

Принципиально такие же наблюдения были сделаны при обследовании взрослых с ОРВИ, осложненной пневмонией. У этих больных была выявлена прямая зависимость между температурой тела и содержанием эндотоксина в плазме крови и обратная зависимость между температурой, тела и содержанием антител к эндотоксину (рис. 9).

Изложенные материалы на наш взгляд достаточно убедительно свидетельствуют о роли эндотоксина в развитии интоксикационного синдрома при заболеваниях дыхательных путей, а также об участии эндотоксина в механизме развития бронхообструктивного синдрома.

Рис.9. Динамика концентрации плазменного ЛПС (■ ) и титра антиRе-антител(■ ) в зависимости от температуры тела. Микро-ЛАЛ-тест, ТИА-антиэндотокс.

Особо необходимо отметить важную роль ЛПС-позитивных ПЯЛ при изучаемой патологии. В частности, в первые три дня развития пневмонии количество ЛПС-позитивных ПЯЛ почти в три раза меньше, чем при неосложненной ОРВИ. Этот факт может быть объяснен миграцией эндотоксин-активированных гранулацитов в легкие, т.к. именно в этот периад и происхадит лейкоцитарная инфильтрация легких – формируется марфологическая картина банального воспаления органа. Именно в этот период, развития заболевания в системном кровотоке обнаруживается большое количество ЛПС-позитивных в том числе (ЛПС-перегруженных) гранулоцитов на фоне более чем пятикратного увеличения концентрации плазменного ЛПС. Причем значительное снижение свободного эндотоксина на 6-10 день развития пневмонии сопровождается почти четырехкратным увеличением количества ЛПС-позитивных ПЯЛ при исчезновении из системного кровотока эндотоксин-перегруженных гранулоцитов. Создается впечатление того, что именно гиперактивированные ПЯЛ и птветственны за развитие осложнения ОРВИ. Механизм развития воспаления при ОРВИ может быть представлен следующим образом: повреждение ("протрава") вирусом эпителиальных клеток, легких и сенсибилизация поврежденной ткани ЛПС (который всегда присутствует во вдыхаемом воздухе) - выброс хемаатрактантов - инфильтрация органа ЛПС-активированными лейкоцитами (в том числе и гиперактивированными аутоагрессивными, см. 3.6.) - деструктивные изменения - типичная морфологическая картина пневмонии. В связи с этим возникает справедливый вопрос. - Почему при ОРВИ резко возрастает концентрация ЛПС в системном кровотоке? По-видимому, это происходит в результате повреждения вирусом эпителия слизистой кишечника. Возможность развития пневмонии при ОРВИ по предложенному нами механизму находит свое подтверждение на секционном материале аспирационной пневмонии (рис. 12) новорожденного, осложнившейся кровоизлиянием в надпочечники (классическая картина эндотоксинового шока, - синдрома Уотерхаза-Фридрихсена): наличие свободного эндотоксина на стенке альвеолы и инфильтрация ткани ЛПС-позитивными ПЯЛ. Не менее интересен и другой факт, - несомненного участия ЛПС-позитивных ПЯЛ в патогенезе бронхообструктивного синдрома при ОРВИ.

Полученные результаты, свидетельствуют о важной (если не ведущей) роли СЭЕ и, в частности ЛПС-позитивных ПЯЛ, в патогенезе острого респираторного дистресс-синдрома (РДС), патогномоничными признаками которого являются как БОС, так и альвеолит.

3.5. Эндотоксин и патология мочеполовой системы

Обобщенные О.Westphal(1975) данные литературы свидетельствуют о важной роли почек в выведении эндотоксина из системного кровотока. Так, при внутривенном введении кролику ЛПС моча приобретает выраженную пирогенную активность. Однако, до настоящего времени неизвестно, какой эндотоксин выводят почки: плазменный ("свободный") или гранудоцит-связанный? Более того, неизвестно какие же структуры мочевыводящей системы ответственны за это? Клубочковый аппарат? Слизистые оболочки лоханок, мочеточников, мочевого пузыря? Или те и другие? Также не определена роль ЛПС в патогенезе острой почечной недостаточности (ОПН) и других видах патологии почек у человека.

Хорошо известно, что ОПН является практически облигатным синдромом шокового процесса любой этиологии в т.ч. эндотоксиновой.

Наши немногочисленные секционные исследования почек при эндотоксиновой патологии, осложненной ОПН, (рис. 10а) показали наличие ЛПС в эпителии, выстилающем клубочковую капсулу Шумлянского-Боуэна, и эпителии проксимальных канальцев. Обнаруженные данные являются прямым свидетельством участия клубочкового аппарата в выведении плазменного ЛПС и, возможно, участия свободного эндотоксина в патогенезе деструктивных изменений, лежащих.в основе развития некронефроза. Мы допускаем возможность того, что именно ЛПС является ответственным за развитие полиурической фазы ОПН. В связи с обнаружением нами эндотоксина в эпителии капсулы клубочкового аппарата весьма интересным представляются результаты исследований G.Morell соавт. [1988], изучавших патогенез ЛПС-индуцированного повреждения почек на изолированном клубочке, которые показали, что ЛПС может быть причиной развития гломерулонефрита. Кроме того, нефротоксический эффект при остром перитоните с ОПН может осуществляться ЛПС-позитивными гранулоцитами (рис. 10б), т.к. эндотоксин-гиперактивированные ПЯЛ обладают полным спектром необходимых для этого биологических свойств и способны сами по себе обусловливать развитие всей гаммы морфологических и клинических нарушений в почках при изучаемой патологии. Подтверждением этого может служить наличие

ЛПС-перегруженных гранулоцитов у аналогичных по тяжести течения заболевания больных острым перитонитом с ОПН и при хроническом пиелонефрите в периферической крови на 2-3 день болезни, а также nриведенные выше данные о резком угнетении антиэндотоксинового иммунитета при разлитом перитоните.

Рис. 10. Почки при геморрагическом инфаркте кишечника с острым перитонитом и ОПН. ЛПС-тест-ИФА. х 400: а) наличие ЛПС в эпителии капсулы Шумлянского-Бауэна и в некротизированных эпителиальных клетках проксимальных канальцев; б) ЛПС-позитивные гранулоциты в интерстиции (слева) и в микрососудах (справа) с явлениями маргинального лейкостаза.

На участие эндотоксина в ренальной патологии косвенно указывают также имеющиеся у нас данные о значительном угнетении гуморального антиэндотоксинового иммунитета при хронической почечной недостаточности.

Об этом же свидетельствуют и факты наличия в периферической крови ЛПС-перегруженных ПЯЛ при различной нефро-урологическои патологии: у25% больных хроническим пиелонефритом (в стадии ремиссии), 33% больных с онкологическими заболеваниями мочевого пузыря в раннем послеоперационном периоде и, что наиболее интересно, - 87% больных мочекаменной болезнью.

Таким образом, почки принимают участие в выведении эндотоксина из системного кровотока. Естественно предположить, что нарушение этого механизма с фиксацией эндотоксина в различных структурах нефрона не может не играть существенной роли в патогенезе заболевания почек и других органов урогенитальной системы. Особое место в реализации патогенного эффекта эндотоксина, по-видимому, принадлежит ЛПС-перегруженным гранулоцитам.

3.6. Эндотоксин и система полиморфноядерных лейкоцитов

Клетки крови различных видов млекопитающих имеют не одинаковую чувствительность к эндотоксину. Наибольшей аффинностью по отношению к ЛПС обладают кроличьи тромбоциты и гранулоциты, а также крысиные мононуклеарные фагоциты, наименьшей - человеческие тромбоциты и эритроциты.

Реакция человеческих гранулоцитов на ЛПС во многом аналогична кроличьей. Справедливость этого была подтверждена нами в предварительных. опытах in vitro на популяции лейкоцитов, которые активно акцептировали бактериальные липополисахариды. Более того верификация in situ ЛПС-позитивных клеток в 500 мазках периферической крови больных с разлитым гнойным перитонитом, хроническим пиелонефритом, очаговой и крупозной пневмонией, травматическим кардиогенным и ожоговым шоком, поздним токсикозом беременности с нефротическим синдромом, мочекаменной болезнью и др. с помощью гематологических окрасок обнаружила весьма любопытный факт: у большинства больных в периферической крови обнаруживались ПЯЛ с высокой интенсивностью люминесценции, что, как правило сопровождалось лихорадкой, изменениями биохимических и гематологических показателей крови. Определялся сдвиг лейкоцитарной формулы влево различной степени выраженности, лейкопения, но чаще лейкоцитоз. У большинства больных в мазках периферической крови практически отсутствовали эозинофилы (ЭФ). У части пациентов отмечалась тромбоцитопения и нередко активация тромбоцитарного ростка (появление бластных форм) костного мозга и др. При просмотре мазков периферической крови наше внимание было привлечено к чрезвычайно ярко светящимся клеткам, намного превосходящим по яркости аффинные к ЛПС ПЯЛ. Клетки встречались далеко не в каждом мазке. Оказалось, что они обнаруживаются в мазках крови, в которых присутствовали единичные ЭФ. Верификация этих супераффинных к ЛПС клеток показала, что ими являются ЭФ (рис. 2). По-видимому, ЛПС и является одним из основных факторов, обусловливающих развитие эозионопении, так как с одной стороны СЭЕ - весьма частое клиническое явление, а с другой - хорошо известна способность ЛПС оказывать лейкопенический эффект с депонированием (секвестрацией) ПЯЛ в микроциркуляторном русле паренхиматозных органов, и, в первую очередь, - в легких. В связи с этим весьма интересны клинические исследования (Наlgеn R. et. аl), показавшие, что в патогенезе повреждения легких при септическом шоке с развитием острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) определенная роль принадлежит ЭФ и, в частности, освобождаемому ими специфическому гранулярному белку - эозинофильному катионному протеину. Плазменная концентрация этого белка значительно возрастает (несмотря на эозинопению), что на наш взгляд может служить ранним диагностическим критерием развивающегося при септическом шоке ОРДС.

Таким образом, полиморфноядерные лейкоциты являются основной эндотоксин-связывающей популяцией.клеток крови, а эозинофил будучи еще более активной к ЛПС-клеткой, может опосредовать патогенный эффект СЭЕ.

При исследовании с помощью ЛПС-ТЕСТа и ЛПС-ТЕСТ-ИФА мазков крови более чем 1000 практически здоровых и больных людей обратило на себя внимание обязательное присутствие в периферической крови различного количества слабо ЛПС-позитивных ПЯЛ. Первоначально этот факт трактовался нами как артефакт (или расценивался как фон), однако проведение самых разнообразных контрольных исследований, включая иммуноблотинг и дот-блот, мы сочли возможным по-иному подойти к оценки этого факта.

Материалом для исследования послужила кровь практически здоровых людей и больных с т.н. грамотрицательными флегмонами нижней челюсти, перитонитом и ОРДС (выполнено совместно с В.Н.Галанкиным.,А.Н.Крупником., А..М.Токмаковым). Исследования морфо-функциональной активности ПЯЛ осуществлялись при помощи методики, разработанной В.Н.Галанкиным с соавт. [1987]: в 5 мл гепаринизированной (20 МЕ/мл гепарина) венозной крови измеряли рН и определяли число ПЯЛ; добавляли в пробирку с кровью бактериальную взвесь, суточной культуры, музейного штамма стафилококкА (10⁹ микробных тел/мл) с рН, равной рН крови, из расчета 10 микробных тел на 1 ПЯЛ; кровь, смешанную с бактериями, инкубировали 30 мин в термостате при температуре тела обследуемого, встряхивали через каждые 10 мин., затем готовили первую серию мазков для изучения поглотительной способности ПЯЛ на светооптическом уровне; остаток крови инкубировали не встряхивая еще 120 мин. при тех же условиях. Через 120 мин. инкубации готовили вторую серию мазков для изучения бактерицидной способности ПЯЛ. Далее проводили фиксацию материалов для электронно-микроскопического исследования по методу, описанному H.Azar и соавт.

Рис.11.Ультраструктура ПЯЛ человека из тест-системы с лейкоцитарно-бактериальной взвесью через 120 мин после добавления бактерий (Staphylococus epedermitis 9198) х 18000. а - умеренно активированный ПЯЛ: не формирует обширных вакуолей, содержащих окружающий клетки субстрат. Активность соответствует задачам переваривания бактерий - в цитоплазме остаточные тельца (ОТ) от переваренных бактерий; б - гиперактивированный ПЯЛ: Формирует обширные вакуоли, содержащие хлопьевидный материал. Степень активации превышает необходимую для выполнения фагоцитарной функции - бактерии перевариваются хуже, одно из бактериальных тел (БТ) не имеет признаков деструкции.

Результаты ультраструктурных исследований позволили разделить ПЯЛ на три группы – неактивированные, умеренно активированные и гиперактивированные (В.Н.Галанкин и coaвт., 1988). В норме в крови доноров находится определенное количество ЛПС-позитивных гранулоцитов и сопоставимое число умеренно активированных ПЯЛ.

Неактивированные ПЯЛ имели правильную округлую форму без псевдоподий, сохранные первичные и вторичные гранулы, не способны к захвату дозированно-добавленных в тест-систему бактерий. Умеренно активированныe ПЯЛ - (рис. 11а) характеризовались способностью образовывать псевдоподии типа лобоподий, формировать облегающие бактериальные тела фагосомы, обладали организованным выбросом содержимого гранул в просвет фагосом, хорошим перевариванием бактерий в тест-системе в течение 120 минут. Полученные данные свидетельствуют о важной роли ЛПС в поддержании системы ПЯЛ в состоянии физиологического тонуса, и, соответственно, - в формировании антибактериального гомеостаза в здоровом организме.

Становятся объяснимыми малопонятные с позиций фагоцитарной теории данные о наличии в крови здоровых людей активированных ПЯЛ. Причины и смысл этой активации находится в полном соответствии с общими закономерностями деятельности физиологических систем: воздействие (в данном случае проникновение ЛПС из кишечника в кровь в обычных условиях) уравновешивается действием транспортно-элиминирующих систем, в том числе системы ПЯЛ, и одновременно поддерживает системы в состоянии физиологического тонуса.

Вместе c тeм, при изучаемой патологии, сопровождающейся лихорад- кой, сдвигом лейкоформулы влево, гипер- или гипокоагуляцией и увеличением плазменного эндотоксина в системном кровотоке отмечалось появление ЛПС-перегруженных ПЯЛ. Одновременно с этим, выявлялись гиперактивированные ПЯЛ. Ультраструктурно (рис. 11б) гиперактивированные ПЯЛ характеризуются образованием нитевидных псевдоподий и обширных неправильной формы мешковидных фагосом, иногда с разрушением их мембран, выходом содержимого гранул непосредственно в цитоплазму с развитием очагового цитолиза. Появляются вакуоли, не содержащие объект фагоцитоза, которые очевидно лишены функционального значения и являются проявлением сверхактивации мембран, возникает значительное количество липидных включений в цитоплазме - как свидетельство деградации гликолипидов .мембран клетки: ухудшаются процессы переваривания микробов в течение120 минут. Гиперактивация ПЯЛ, связаннаяная с возникновением сверхвысокой текучести мембран отражает нарушение внутри- клеточных регуляторных механизмов фагоцитоза, приводит, к неэкономному расходованию бактерицидного потенциала клетки, снижению ее функциональной активности и, по нашему мнению, может обусловливать аутоагрессивность ПЯЛ как по отношению к самим себе, так и окружающим их клеткам и тканям.

Обнаруженные нами морфо-функциональные изменения ПЯЛ согласуются с литературными данными (полученными в экспериментах in vitro и in vivo) о способности ЛПС воздействовать на функциональные возможности ПЯЛ и, порой, их извращать.

Многочисленные публикации, как и собственные данные морфологических исследований экспериментального (эндотоксиновый шок на кроликах) и секционного (перитонит и др.) материала подтверждают выдвинутую нами концепцию участия ЛПС-позитивных. ПЯЛ в патогенезе эндотоксин-индуцированной патологии.

Исследования легочной ткани кролика обнаружили, что уже спустя 30 минут после инфузии ЛПС количество ПЯЛ в микрососудах значительно увеличивается, большинство гранулоцитов, находящихся в маргинальном cocтоянии, ЛПС-позитивны, при этом отмечается незначительный oтeк интерстиция. Выраженность последнего значительно возрастает к 1 часу исследования, когда обнаруживаются признаки повреждения эндотелия (набухание его, десквамация), петехиальные кровоизлияния, лериваскулярный отек, что происходит на фоне нарастания явлений маргинального лейкостаза и появления ЛПС-лозитивных ПЯЛ в интерстиции. К 5 часу наблюдения секвестрация ПЯЛ в микрососудах легких достигает своего максимума. Десквамация эндотелия наиболее выражена, нарастают явления периваскулярного и интерстициального отека, увеличивается количество интерстициальных ПЯЛ. Единичные ЛПС-позитивные ПЯЛ появляются в просвете альвеол и мелких бронхов, выявляются признаки повреждения пневмоцитов и явления дистелектазов, носящие очаговый характер. Эти изменения нарастают к 10 часу наблюдения и достигают своего максимума к концу первых суток исследования. Часть маргинальных интерстициальных ЛПС-позитивных ПЯЛ имеют признаки повреждения. Резкий отек интерстиция, периваскулярных пространств и паренхимы сочетается с петехиальными кровоизлияниями и наличием в альвеолярных пространствах ЛПС-позитивных ПЯЛ и альвеолярных макрофагов (АМ). Отмечаются повреждения пневмоцитов и прогрессирование дистелактазов. Таким образом, выведение ЛПС из легких (и организма) реализуется системой ПЯЛ, которая играет важную роль и в повреждении легочной ткани. В связи с этим приобретает важное значение определение роли АМ в механизме осуществления дренажной функции легких при СЭЕ, тем более, что и ЛПС-активированные макрофаги могут быть важным фактором повреждения органа.

Взаимодействие ЛПС-позитивных ПЯЛ с альвеолярными макрофагами (АМ) изучалось в исследованиях in vitro. АМ выделялись из бронхоальвеолярного лаважа с последующей очисткой в смеси Фиколл-верографин, а ПЯЛ - из цельной стабилизированной крови того же кролика, отстаивавшейся при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем клетки инкубировали в растворе Хенкса (рН=7,4) жизнеспособность их оценивалась по эксклюзии метиленового зеленого и составляла не менее 90%. Выделенные ПЯЛ в количестве 8х10 инкубировали с раствором ЛПС (2 мг/мл) в течение 1 часа при 37°С (жизнеспособность клеток не снижалась), трижды отмывали путем центрифугирования в растворе Хенкса, а затем инкубировали со взвесью АМ в количестве 4х10 1 час при 37º С (1 серия). Три других серии эксперимента были контрольными; 2)АМ инкубировали с неактивированными ЛПС ПЯЛ; 3)АМ инкубировали с раствором Хенкса; 4)АМ инкубировали 1 час с различными растворами ЛПС (от 0,0005 до 5,0 мг/мл) – с целью определения токсичных для АМ доз ЛПС. Соответственно приготавливали в каждом случае по три мазка, которые исследовались методом люминесцирующих антител к R-гликолипиду, с последующей верификацией клеток по Май-Грюнвальду, а в 4 серии определялась жизнеспособность АМ по эксклюзии метилового синего. Для блокировки свободных Fс-фрагментов клеток перед инкубацией с люминесцирующими антителами использовалась баранья сыворотка. Для исключения аутолюминесценции отобранные поля предварительно исследовались.

В 1 серии иммуноморфологическое исследование обнаружили наличие ЛПС в 80% AМ, тогда как во 2 и 3 сериях он определяется лишь в 5% АМ. В ЛПС-позитивных АМ 1 серии обнаружена значительная вакуолизация цитоплазмы, точечные просветления в ядре и увеличение ворсинчатости клеточной мембраны. Часть ЛПС-позитивных ПЯЛ поглощается видимо АМ целиком. Последнее представляется весьма важным фактором, поскольку чувствительность АМ к ЛПС значительно выше, чем у ПЯЛ (при инкубации с 0.5 мг/мл ЛПС жизнеспособны, только 50% АМ при 0,05 мг/мл - 70% АМ), а гибель АМ может быть фактором повреждения легких. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о возможности передачи JЩС от ПЯЛ к АМ и/или фагоцитозе АМ ПЯЛ.

Определенную роль АМ играют в механизмах развития OPДC, т. к. ЛПС-активированные АМ, освобождая супероксидные радикалы и протеолитические ферменты, повреждают близлежащие эпителиальные клетки, неколлагеновые компоненты базальной мембраны (фибронектин) и способствуют отложению фибрина в альвеолах (Show R. et al. 1982), что обнаруживалось и нами в экспериментах на кроликах. N. Freudenberg и, соавт. (1984) в экспериментах на крысах отмечали поразительную взаимосвязь между появлением ЛПС-позитивных АМ и, повреждением легочной ткани. В этой связи представляются весьма интересными обнаруженные нами факты наличия эндотоксинпозитивных АМ и ПЯЛ в альвеолах, альвеолярных перегородках, и бронхах умерших (рис. 12). Участие АМ в выведении ЛПС из организма, их способность фагоцитировать ЛПС-положительные ПЯЛ, обнаруженная –in vitro, могут быть причиной гибели АМ и повреждения прилегающих паренхиматозных элементов. В то же время наличие 5-10% ЛПС-положительных АМ в бронхоальвеолярном лаваже интактных кроликов может быть свидетельством защиты органа от ингалируемого NПС и (или) выведения его из организма в норме.

Об участии гранулоцитов в патогенезе эндотоксин-индуцированного повреждения легких (в том числе ОРДС) свидетельствуют и многочисленные литературные данные. Доза внутривенно введенных ЛПС прямо пропорциональна увеличению выделения ПЯЛ из легких (J.Rinaldo, J Dauber 1985). Абсолютное число ПЯЛ в бронхоальвеолярном лаваже значительно возрастает к 24 и 48 ч. после введения ЛПС крысам в кровь. Однако при инстиляции анестетиков или просто интубации, несмотря на то, что ПЯЛ подвергаются агрегации в сосудах микроциркуляции легких после введения ЛПС, активированные ПЯЛ не мигрируют из капиллярного русла в воздушные пространства (J. Chang., М. Lesser 1984). Эти данные представляют чрезвычайно большой интерес, если их сопоставить с результатами исследований J.Rinaldo и J.Dauber (1985), которые сравнили выживаемость крыс и интенсивность нейтрофильного альвеолита, развивающегося после интраперитонеального введения ЛПС, при дыхании обычным воздухом, содержащим кишечную палочку и 60% кислородной смесью. Оказалось, что дыхание гипероксичной смесью уменьшало явления нейтрофильного альвеолита, но повышало (!) летальность в группе экспериментальных животных.

Рис. 12. Легкие ребенка, умершего на З-тьи сутки от аспирационной пневмонии, осложнившиейся кровоизлияниями в надпочечники. ЛПС-тест-ИФА. а - участок альвеолы, с расположенными на стенке ЛПС-позитивными АМ. х300; б - то же поле зрения. х800; в - участок альвеолы с ЛПС-позитивными ПЯЛ, прокрашивание стенки бронхиолы. х300; г - контроль. То же поле зрения, что на рис. 12в. х300: д- то же поле зрения, что на рис. 12в. х500; е - контроль. То же поле зрения, что на рис. 12д. х300; ж - фрагмент слизистой бронха, специфическое окрашивание эпителия. х300; з - контроль. То же поле зрения, что на рис. 12ж. х400.

Таким образом, допустимо сделать заключение о том, что выведение ЛПС из организма через легкие сопровождается развитием нейтрофильного альвеолита и тяжелыми структурными повреждениями ткани легких, развитием ОРДС. Приведенные данные позволили нам предположить, что ведущей транспортной единицей, осуществляющей вывод ЛПС из крови через легкие, является ПЯЛ. В связи с этим представляется целесообразным кратко раскрыть возможное участие ПЯЛ в патогенезе ОРДС. Известно, что предварительное истощение системы ПЯЛ в эксперименте не снимает легочную гипертензию, но значительно уменьшает повреждение легких, особенно в поздней фазе повышения сосудистой проницаемости, и имеются морфологические и биохимические данные, свидетельствующие об участии ПЯЛ в повреждении эндотелиальных клеток. В частности. E.Warble (1980) считает, что секвестрация ПЯЛ с их фрагментацией и высвобождением ферментов обусловливает повреждение эндотелия капилляров и увеличение их проницаемости. Обнаружена положительная корреляция между аккумуляцией ЛПС в легких, секвестрацией ПЯЛ и подъемом уровня кислой фосфатазы в плазме крови (M.Garnett et а1. 1980). Известно, что при контакте с достаточно большим количеством ЛПС из ПЯЛ высвобождаются такие биологически активные агенты, как протеазы, лизосомальные ферменты и радикалы кислорода, которые могут повреждать мембрану эндотелиальных клеток и способствовать повышению проницаемости (Wong G. et а1. 1985).

ПЯЛ могут участвовать в патогенезе ОРДС через кининовую систему, а содружествнно патогенный эффект комплемента и ЛПС можно представить в виде следующей цепочки: ЛПС-обусловленное (с помощью прямого протеолитического распада нативной С₅-фракции комплемента) образование пептидов - повышение адгезивности ПЯЛ и их маргинация - повреждение эндотелия микрососудов обусловленное пептидом, содержащимся вС₅ и ПЯЛ. Поэтому вполне логично допустить, что эндотоксинобусловленное повреждение легких при ОРДС является одновременно ПЯЛ-зависимым.

Таким образом. правомочно заключить, что гранулоциты передают эндотоксин альвеолярным макрофагам "с рук на руки" не только ценой своей жизни, но и ценой повреждения ткани легких с развитием ОРДС.

Аналогичного рода повреждения ЛПС-гиперактивированные лейкоциты могут вызывать и в других органах.

В настоящее время известны несколько видов взаимодействия ЛПС с ПЯЛ и макрофагами (Lynn W.А., О.Т. Gollenboоk. 1992): а) ЛПС связывается с рецепторным белком СД18, причем такое связывание не является необходимым, для активации гранулоцитов; б) ЛПС связывается сначала с белком LBP плазмы, а затем в комплексе с этим белком реагирует с рецептором СД14, что ведет к активации лейкоцитов; в) неспецифическое взаимодействие ЛПС с мембранами клеток. К этому следует добавить также описанное в нашей работе Fс-зависимое связывание ЛПС клетками, армированными антиэндотоксицовыми антителами. Вклад этих видов связывания в протективную и патогенетическую роли гранулоцитов пока еще не изучен. По-видимому, исход взаимодействия ЛПС с лейкоцитами и свойства ПЯЛ, индуцированные ЛПС, зависят от концентрации эндотоксина; при относительно низких концентрациях имеет место активация и положительный (физиологический) эффект, при высоких концентрациях – гиперактивация, перегрузка лейкоцитов и патологический эффект (развитие органопатологии).

3.7. Эндотоксин и сердечно-сосудистая патология

Первые данные о возможности участия эндотоксина в сердечно-сосудистой патологии мы получили еще в 1987г. С помощью ЛПС-теста при кардиогенном шоке в системном кровотоке были впервые обнаружены эндотоксин-перегруженные гранулоциты: Объяснили мы этот факт повышенным поступлением кишечного ЛПС и развитием портальной гипертензии как следствие системной и локальной недостаточности кровообращения. Исходя из этого нам представилось интересным более подробное рассмотрение этой проблемы в эксперименте.

Наиболее приближенной к клинике моделью кардиогенного шока является генерализованный феномен Шварцмана (ГФШ), который моделировался на140 кроликах породы «шиншилла» путем двукратной (с интервалом в 24 часа) внутривенной инъекции ЛПС.

3.7.1. Морфологические изменения в органах при генерализованном феномене Шварцмана

Обнаруженные нами паталогоанатомические изменения во внутренних органах (легкие, печень. почки, селезенка, тимус, надпочечники, кишечник) соответствовали хорошо известной, ставшей уже классической, картине повреждения органов и тканей при генерализованном феномене Шварцмана. Наряду с многочисленными проявлениями дистрофических и десмолитических процессов (в ранней фазе ГФШ) в паренхиме и строме обращал на себя внимание, на наш взгляд, наиболее патогномоничный для СЭЕ симптом системного маргинального лейкостаза(СМЛ) в венулярном отделе внутренних органов, который во времени предшествовал альтеративным изменениям эндотелиальных клеток. В отличие от билатерального некронефроза (по данным Б.А.Саакова и соавт., являющегося облигатным признаком ГФШ), который встречался крайне редко (в 10% наблюдений), СМЛ является атрибутом изучаемой патологии. Наиболее интересными (и новыми) представляются результаты исследования миокарда.

3.7.2. Эндотоксин-индуцированное повреждение сократиrельного аппарата кардиомиоцитов

Анализ клинических исследований последних лет позволяет констатировать наличие сердечной недостаточности уже в ранней фазе клиники ЭШ и квалифицировать ее как фактор, лимитирующий жизнеспособность пациента в более поздний период развития патологического процесса. Вместе с тем, проведенные нами совместно с Д.Ш. Еналеевой (1979) исследования в эксперименте на кроликах показали, что сердечной недостаточности при ЭШ предшествует мобилизация резервной силы сократимости миокарда.

Морфо-гистохимические исследования миокарда кролика в динамике ЭШ идентифицировали морфологический субстрат как усиления сократительной функции сердечной мышцы, так и сердечной недостаточности.

Гистоэнзиматически на ранних сроках обнаруживалось значительное повышение активности ферментов энергетического (СДГ, НАД) и пластического обменов (Гл-6-ФДГ, НАДФ, ГДГ) в субэндокардиальном слое и толще миокарда. Вместе с тем, уже в эти сроки наблюдения появлялись очаги внутриклеточного миоцитолизиса. В динамике развития количество клеток с этим видом повреждения миофибриллярного аппарата прогрессивно нарастало (рис. 13 а). В случаях тяжелого течения патологического процесса (погибшие животные) определялись кардиомиоциты, практически лишенные миофибрилл (рис. 13 б) вплоть до появления очагов колликвационного некроза (рис. 13 в). Вместе с тем, уже в первые часы развития ЭШ параллельно с нарастанием миофибриллолизиса определялись единичные кардиомиоциты (битые животные) с морфологическими признаками репаративного процесса 9рис.13 г).

Рис.13. Преобладающий вид морфологических изменений в субэндокардиальном отделе левого желудочка сердца в динамике развития ЭШ: а - множественные очаги внутриклеточного миоцитолизиса. Съемка в поляризованном свете. х 250; б - обширный очаг миофибриллолизиса. "Пустые клетки". Окраска гематоксилин и эозином. х 630. в - обширный очаг выпадающего некроза. Окраска гематоксилин и эозином. х 84. г - регенерация очагового внутриклеточного миоцитолизиса - появление анизотропной субстанции, приобретающей поперечную исчерченность. Съемка в поляризованном свете.Х 630.

Ведущим типом повреждения сократительного аппарата кардиомиоцитов субэндркардиального слоя сердечной мышцы являлся очаговый миоцитолизие, начинающийся с перинуклеарной зоны, который развивался на фоне повышенной активности ферментов пластического и энергетического обмена, что позволило нам квалифицировать данный процесс как морфологический эквивалент относительной пластической недостаточности этого наиболее функционально отягощенного отдела миокарда. При тяжелом течении ЭШ (погибшее животное) или на 5-8-е сутки развития патологического процесса очаговой миоцитолизис кардиомиоцитов внутреннего слоя миокарда мог распространяться практически на всю клетку. Однотипный процесс именно в субэндокардиальном отделе сердечной мышцы обнаружен А.М.Вихертом и соавт.' (1986) у внезапно умерших людей.

Коэффициент повреждения субэндокардиального слоя миокарда в зависимости от тяжести течения ЭШ представлен в табл. 14.

Таблица 14

Коэффициент повреждения сердечной мышцы при ГФШ

Серия опытов	Погибшие животные		Забитые животные
	наружный слой пн	внутренний слой пв	наружный слой зн	внутренний слой зв
I	54,9 – 1,4 Р1пн-1зн<0,001 Р2пн-1зн>0,05 Р1пн-5зн<0,001 Р1пн-4зн<0,001	34,6 – 1,4 Р1пв-5зв<0,001 Р1пв-2пв<0,01 Р1пв-4пв>0,05	20,0 – 2,0 Р1зн-2зн>0,05 Р1зн-3зн>0,05 Р1зн-4зн>0,05 Р1зн-5зн<0,001
II	52,3 – 1,75 Р2пн-2зн<0,001 Р2пн-5зн>0,001 Р2пн-4зн<0,001	28,5 – 1,2 Р2пв-2пв<0,02 Р2пв-5зв<0,001 Р2пв-4зв>0,02	20,8 – 0,8 Р2зн-3зн>0,05 Р2зн-4зн>0,05 Р2зн-5зн>0,001	24,4 – 0,95 Р2зв-3зв<0,02 Р2зв-4зв<0,001 Р2зв-5зв<0,001
III			21,3 – 1,57 Р3зн-4зн>0,05 Р3зн-5зн>0,001	20,4 – 1,2 Р3зв-4зв<0,02 Р3зв-5зв<0,001
IV	19,5 – 0,7 Р4пн-4зн>0,05 Р4пн-5зн<0,001	34,9 – 1,6 Р4пв-4зв<0,001 Р4пв-5зв<0,001	21,7 – 1,1 Р4зн-5зн<0,001	17,9 – 0,5 Р4зв-5зв<0,001
V			0,4 – 0,35 Контроль	2,5 – 0,3 Контроль

Статистически значимые различия коэффициентов повреждения внутреннего слоя миокарда поги6ших и забитых животных свидетельствуют о том, что коэффициент повреждения субэндокардиального слоя сердечной мышцы более 30 является критическим для жизнеспособности организма.

Таким образом, в субэндокардиальном слое миокарда происходит своеобразная поляризация биологических процессов и, если в группе забитых животных, она идет по пути усиления (адекватного) синтетических процессов, то в группе погибших животных – миофибриллолитических, свидетельствующих о пластической (а значит и сократительной) недостаточности сердечной мышцы.

Ведущим, если не единственным, типом повреждения сократительного аппарата субэпикардиального отдела миокарда является контрактурный тип, а в целом морфологическая картина практически идентична реперфузионой (различные виды контрактурного повреждения, глыбчатый распад, peлаксация миофибрил), что наряду с наличием в этом слое спазмированных артерий и следов перенесенной аноксии в виде плазматического пропитывания стенок навело нас на мысль об участии транзиторного коронароспазма (т. к. тромбоз артерий нами не наблюдался ни в одном случае) в патогенезе этого повреждения. В патогенезе транзиторного коронароспазма (ТКС) могут принимать участие два фактора: гиперкатехоламинемия (косвенным подтверждением которой является обнаруженное нами значительное повышение активности моноамнооксидазы) и обнаруженная нами неспособность кардиомиоцитов наружного слоя отвечать на нее повышением активности ферментов (сохраняется линейная форма отложения формазана) аэробного метаболизма. Только в этой ситуации наступает своеобразный "паралич" метаболического механизма отмены катехоламин-обусловленной вазоконстрикции. Кроме того, у погибших животных в наружном слое определялись субсегментарные контрактуры, являющиеся патогномоничными для перенесенной фибрилляции желудочков, причиной которой может быть реперфузия. В этой связи весьма интересными представляются клинические наблюдения F.Thomas с соавт. (1986), которые обнаружили у больных ЭШ характерные для инфаркта миокарда электро- и эхокардиографические изменения. ТКС в условиях ЭШ может иметь и определенное адаптивное значение - перераспределять коронарный кровоток в сторону наиболее функционально отягощенных (активных) субэндокардиальных отделов миокарда в ущерб наружным, вплоть до "самоампутации" субэпикарда. Об этом прямо свидетельствуют соотношения коэффициентов повреждения наружного и внутреннего слоев миокарда в зависимости от тяжести течения шокового процесса (табл.14). Статистически достоверное снижение коэффициента повреждения наружного слоя миокарда погибших животных сопровождается увеличением количества поврежденных клеток внутреннего слоя сердечной мышцы, тогда как у выживших отмечается обратная тенденция, что подтверждает наше предположение о том, что явление, называемое нами феноменом централизации кровообращения в сердечной мышце, является адаптивным по своему характеру.

Полученные данные обусловили необходимость проведения дополнительных исследований в части определения возможности развития инфаркта миокарда на базе ТКС.

Для этой цели нами была разработана методика, позволяющая моделировать ТКС с достаточной атравматичностыо и возможностью постоянного контроля за объемом кровотока в коронарных артериях дистальнее местаокклюзии.

Опыты проводили на 12 кроликах-самцах породы шиншилла массой 3.5 - 4 кг, которые составили 3 группы исследования. Все манипуляции на животных производили под гексаналовым наркозом в условиях искусственной вентиляции легких атмосферным воздухом. В I (контрольную) серию опытов было взято 3 животных, которым производили ложную операцию 6ез ТКС, во II - 3 кролика, трижды перенесших коронароспазм (КС) длительностью 1 мин с интервалами между ними 5 мин, в III - 6 животных, трижды перенесших 5-минутный КС с реперфузионным периодом 5 мин. Все животные на протяжении 2 ч находились под непрерывным электрокардиографическим контролем.

В миокарде животных контрольной группы 14-17% кардиомиоцитов находилось в состоянии контрактурных изменений, заключавшихся в повышенной анизотропии, уменьшении и исчезновении l-ДИСКОВ(РИС.14 а). Практически идентичная картина наблюдалась в интактной зоне миокарда кроликов II и III серий опытов. На электрокардиограмме (ЭКГ) животных I отмечалась незначительная тахикардия.

Во II серии эксперимента уже после первого КС регистрировался незначительный подъем сегмента ST, который к моменту второго КС снижался, но не достигал исходного уровня. Во время второго КС сегмент ST поднимался и практически не изменялся в реперфузионном периоде. Наибольший подъем этого сегмента происходил во время третьего КС, когда появлялись и пароксизмы тахикардии; в реперфузионном периоде ритм восстанавливался, сегмент ST снижался (но не достигал изначального уровня), стабилизировался к 20-й минуте реперфузии и оставался неизменным до завершения исследования. Для ишемизированной зоны миокарда данной серии эксперимента характерны уменьшение I дисков в большинстве кардиомиоцитов, контрактурные изменения миофибрилл, обнаруживавшиеся в 21-24% сократительных клеток, и единичные клетки с первично-глыбчатым распадом. Таким образом, даже непродолжительный по времени ТКС (модель кратковременного стенокардического приступа) может быть причиной развития мелко очагового кардиосклероза, а позже и гипертрофии, как варианта структурной (пластической) адаптации к утраченной структурно-функциональной единице.

Рис. 14. Контрактурные изменения миокарда при транзиторном коронароспазме (съемка в поляризованном свете): а-контроль: повышенная анизот-миоциты находятся в состоянии контрактурного повреждения (рис.15 в). миокард погибшего животного (III серия опыта): субсегментарные контрактуры(светлые полоски), х700; в- миокард бассейна спазмируемой коронарной артерии: первично-глыбчатый распад, необратимые контрактурные повреждения, сохранившиеся кардиомиоциты, х 300.

В III серии опытов наблюдалась несколько иная морфологическая и ЭКГ-картина. Нарушения ритма носили прогрессирующий характер, ухудшалась проводимость, в одном случае животное погибло от фибрилляции желудочков (рис. 14 б). Снижения сегмента ST не наблюдалось ни в одном из реперфузионных периодов, а подъем его нарастал от КС к КС. Более того, на протяжении всего 1.5-часового периода реперфузии вплоть до завершения эксперимента высота сегмента практически не снижалась. В зоне ишемии миокарда в этой серии опытов в больщинстве сократительных клеток определялись контрактурные изменения, носившие необратимый характер в 35-50% случаев (рис. 14 в). Группы кардиомиоцитов с первично-глыбчатым распадом и необратимой контрактурой для которой характерен единый анизотропный конгломерат распределялись по срезу миокарда преимущественно мозаично. Таким образом, данный вариант ТКС может служить моделью для индуцирования мелкоочагового инфаркта миокарда или столь часто встречающейся острой коронарной недостаточности.

Обнаруженные контрактурные повреждения миофибриллярного аппарата свидетельствуют о нарушении функции кардиомиоцитов. По-видимому в генезе нарушения функции сарколеммы принимают участие метаболиты арахидоновой кислоты и эндоперекиси, поскольку способность ишемии активировать фосфолипазу А2 хорошо известна, а реализация патогенного эффекта этой активации возможна лишь при наличии кислорода; т.е.реперфузии.

Таким образом, в субэпикардиальном слое миокарда при экспериментальном ЭШ ведущим типом повреждения является контрактурный, одной из причин развития которого может являться транзиторный коронароспазм, лежащий в основе феномена централизации кровообращения в сердечной мышце. Следовательно, одной из возможных причин развития ишемического повреждения миокарда (и его инфаркта) может быть транзиторный коронароспазм.

Кроме того, определенная роль в патогенезе повреждения миокарда при ЭШ может принадлежать ПЯЛ. К сожалению, до настоящего времени многочисленные факты развития лейкостазов и инфильтрации ПЯЛ стромальных и паренхиматозных структур миокарда при различных патологических процессах оценивались лишь как реактивный (в ответ на повреждение) процесс резорбции разрушенных структур или как процесс, направленный на уничтожение и элиминацию чужеродных антигенов бактериального происхождения. При ЭШ феномен лейкостаза определялся преимущественно в венулярном отделе сосудистого ложа сердечной мышцы кроликов, погибших через 0.5-1.5 ч после повторного внутривенного введения ЛПС (рис. 15 а). Параллельно с этим происходило набухание эндотелиальных клеток и деэндотелизация (рис. 15 б), которые, как нам представляется, может быть связано с продукцией активированными эндотоксином ПЯЛ различных токсических субстанций. Лейкостаз нарастал в течение l-х суток исследования и прямо коррелировал с прогрессированием деструктивных процессов в различных структурных компонентах сосудистой стенки, что согласуется с данными C.Dahinden и соавт. (1990), обнаружившими снижение миграционной способности активированных эндотоксином ПЯЛ при значительной активации в них метаболических процессов и гиперадгезивности. Этот факт особенно интересен в связи с данными о том, что рецепторная регуляция выхода ПЯЛ локализована в эндотелиальных клетках посткапиллярных венул. Вполне возможно, что именно поэтому, равно как и благодаря нарушению анатомической целостности стенки венул маргинальные ПЯЛ выходят за пределы сосуда через сутки после введения эндотоксина, т.е. тогда, когда феномен деэндотелизации наиболее выражен. И, пожалуй, наиболее интересным представляется нам то, что прилежащие к деструктивно измененным венулам и зонам лейкодиапедеза кардиомиоциты находятся в состоянии контрактурного повреждения (рис. 15 в).

Рис 15. Гранулоцит-индуцированное повреждение сосудистой стенки и кардиомиоцитов: а - агрегация и пристеночное стояние ПЯЛ в венуле. х 800; б - десквамация эндотелиальных клеток. х 800; в -деструктивные изменения стенки сосуда и прилежащего к нему миокарда, скопления ПЯЛ. х 300. а,б,в, - окраска гематоксилин и эозином.

Возможно, мы имеем здесь дело с прямым повреждающим действием активированных эндотоксином ПЯЛ на сарколемму кардиомиоцита. К такому выводу мы пришли на основании результатов комбинированного метода исследования: поляризационной микроскопии, позволяющей дифференцировать обратимые и необратимые виды контрактурного повреждения сократительного аппарата и разработанного нами способа идентификации активированных эндотоксином ПЯЛ.

По сути поставленная проблема гораздо шире выяснения роли опосредованного ПЯЛ повреждающего миокард действия эндотоксина при ЭШ, поскольку эти же механизмы могут иметь значение в патогенезе рецидивирующего инфаркта миокарда, алкогольной кардиомиопатии и идиопатического миокардита.

Таким образом, представляется возможным заключить, что сердечная недостаточность является облигатным компонентом ЭШ. Структурная основа сердечной недостаточности при ЭШ неспецифична и включает в себя миофибриллолитические и контрактурные повреждения кардиомиоцитов в сочетании с диапедезом ПЯЛ в зонах повреждения. Одним из наиболее перспективных направлений изучения патогенеза сердечной недостаточности является выяснение роли эндотоксин-гиперактивированных гранулоцитов в механизме повреждения стромальных и паренхиматозных структур сердца с помощью комбинированного метода - поляризационно-иммуноферментной микроскопии.

Эндотоксин оказывал выраженное действие также и на эндотелий. Альтеративные изменения эндотелиальных клеток и их десквамация наблюдается уже в первые часы развития экспериментальной СЭЕ. В патогенезе повреждения сосудистого эндотелия помимо ЛПС-перегруженных ПЯЛ может ринимать участие непосредственно сам эндотоксин или опосредовано через различные гуморальные факторы (комплемент и др.) при самых разнообразных экстремальных состояниях, сопровождзющихся СЭЕ. Вместе с тем, эта способность ЛПС может быть и атерогенным фактором. В частности, E.Pesonen и соавт. (1981) считают повреждение эндотелия главным фактором развития атеросклероза. В этой связи представляются весьма интересными обнаруженные нами факты пролиферации эндотелиальных клеток (уже на третьи сутки развития ЭШ) миокарда кролика и процессы новообразования сосудов уже нa шестые сутки исследования. Кроме того, ряд авторов считают, что ЛПС способен стимулировать пролиферацию и гладкомышечных клеток. Наши наблюдения находятся в соответствии с известной способностью ЛПС активировать протеинкиназу С, которая является ключевым ферментом, снимающим репрессию с генома, тем самым запускающим пролиферативный процесс. Более того, результаты исследований Reidy М. и Schwartz S. (1983) обнаружили, что дефекты эндотелиальной выстилки аорты кролика размерами в 1-2 клетки способны "закрываться" уже через 8 часов после внутривенной инъекции ЛПС. Способность эндотоксина обуславливать как повреждения, так и пролиферацию эндотелиальных клеток действительно может играть не последнюю роль в патогенезе атеросклероза. Представления о возможном участии ЛПС в патогенезе атеросклероза, безусловно требуют пристального внимания и изучения.

3.8. Поиск веществ с антиэндотоксин-модулирующей, активностью

Последние годы характеризуются активным поиском веществ с антибактериальной и противошоковой активностью. Успехи в этом направлении не столь уж впечатлительны, поэтому дальнейшие исследования в этой области имеют огромную практическую значимость. В принципе, препараты антиэндотоксинового действия должны отвечать следующим требованиям: относительная простота синтеза и доступность сырьевой базы, водорастворимость, термостойкость, достаточно высокая активность в относительно низких дозах, безвредность. К этому необходимо еще добавить обязательное наличие доступной и адекватной модели для оценки биологического действия вещества.

Таблица 15

Действие производных альфа-имидазолилалкилсульфоновой кислоты при эндотоксиновом шоке у мышей

Соединение

МТД

мг/кг

Кол-во введен-ного в-ва мг/кг

Леталь-ность, %

Эффектив-

ность

N ---- C CH₃ O

1273 N – C ---S---OH

C ---- C CH₃ O

600

15

41

1-4 кратный

защитный

эффект

N ---- C C₂H₅ O

1273 N – C ----S---OH

C ---- C C₂H₅ O

500

12,5

8

3- 5 кратный

защитный

эффект

Преднизолон-базовый

объект

30

30

41

1-4 кратный

защитный

эффект

Контроль

-

-

58

Анализ химической структуры различных биологически активных соединений, приведенный совестно с д.х.н., профессором Б.Е.Ивановым и к.х.н. В.Б.Ивановым. позволил предположить, что ожидаемая нами биологическая активность может быть у некоторых производных сульфоновой кислоты. Для проверки этого предположения были синтезированы производные альфа-имидазолилалкилсульфоновой кислоты, у 12 из них была изучена биологическая активность на модели эндотоксинового шока у белых мышей при введении ЛПС в дозе LD_50. При этой дозе наблюдалась клиническая (кратковременное двигательное возбуждение, сменяемое коматозным состоянием) и морфологическая картина, свойственная любому шоковому процессу.

Для каждого изученного соединения была определена минимальная токсическая доза (МТД). При изучении антиэндотоксин-шоковой активности вещества вводили внутривенно в дозе 1/40 МТД через 30 минут после введения ЛПС в дозе LD_50. Для сравнения контрольной группе животных вводили преднизолон в дозе 30 мг/кг. Из 12 веществ было отобрано 2, которые давали или более высокий (соединение N1350) или такой же (соединение N1273) эффект как преднизолон (табл.15).

На модели агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ или адреналином, показано также, что препараты обладают более или менее выраженной анти- и дезагрегирующей активностью.

Позднее в исследованиях А..М.Девятаева была показана способность этих веществ увеличивать силу скелетных мышц. О.К.Поздеев обнаружил у препарата N 1273 наличие иммуностимулирующего эффекта. Наиболее полно вещество М1273 было изучено Н.Н.Камбургом, который показал, что оно обладает выраженным Н-холинолитическим действием, дает центральный адренолитический, ГАМК-литический и противовоспалительный эффект, обладает антиоксидантной, иммуностимулирующей активностью, ингибирует синтез холестерина, увеличивает скорoстную выносливость, увеличивает продолжительность гексеналового сна и, наконец, обладает антиатеросклеротической активностью.

Сочетание антиатеросклеротических и антиэдотоксин-шоковых свойств препарата N1273 вызывает особый интерес, так как не исключено, что эндотоксин может инициировать и или способствовать развитию атеросклероза.

4. Заключение

Разработанные новые способы диагностики СЭЕ (микро-ЛАЛ-тест, ЛПС-тест, ЛПС-тест-ИФА) и оценки состояния антиэндотоксинового иммунитета (ТИА-антиэндотокс, СОИС-ИФА) позволили получить ряд новых и принципиально важных данных о роли эндотоксина в физиологии и патологии человека. Прежде всего, речь идет о том, что в физиологических условиях практически у всех здоровых людей имеет место так называемая физиологическая СЭЕ. При этом эндотоксин обнаруживается в плазме и на поверхности ПЯЛ. Из этого следует несколько заключений и, прежде всего то, что эндотоксин проникает в системный кровоток значительно чаще, чем это было принято считать ранее. Проникая в системный кровоток здоровых людей в оптимальном для достижения физиологического эффекта концентрации, ЛПС участвует, по-видимому, в реакциях иммунной защиты за счет, как минимум, трех ключевых механизмов: активации ограниченного пула ПЯЛ, индукции синтеза важнейших медиаторов и цитокинов пептидной природы и умеренной поликолональной активации В-лимфоцитов. Разумеется, при этом не исключены и другие механизмы участия элиминированных в системный кровоток (или адсорбированных на клеточных структурах) ПЯЛ. В любом случае не исключено, что присутствие в крови ограниченной популяции ПЯЛ, "вооруженных" (армированных) антителами для связывания ЛПС при помощи Fс-зависимого механизма, запускает в действие те эволюционно детерминированные защитные эндотоксинсвязывающие механизмы, отсутствие которых приводит к острым воспалительным и другим заболеваниям.

По содержанию ПЯЛ, связавших ЛПС в организме обследуемого, а также лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин, можно судить о состоянии антиэндотоксинового иммунитета и резистентности организма в целом. Информацию об этом дает также наличие антиэндотоксиновых антител к ЛПС E.col1 014, несущему общий антиген энтеробактерий. Низкое содержание антиэндотоксиновых антител и угнетенная активность Fс-зависимого связывания характерны для патологических процессов. Из этого следует, что клеточные и гуморальные факторы антиэндотоксинового иммунитета, их активное (полноценное) функционирование весьма необходимы для поддержания гомеостаза. С другой стороны, полученные данные свидетельствуют о вовлечении ЛПС в механизмы развития ряда патологических процессов (как инфекционного, так и неинфекционного генеза). На это указывают не только результаты, документирующие низкую активность эндотоксинсвязывающих систем, но и повышенное содержание ЛПС в плазме крови и/или на гранулоцитах в поврежденных органах и тканях. Именно ЛПС-перегруженные ПЯЛ играют важную роль в развитии органопатологии. Все это позволяет сделать заключение о том, что эндотоксин является мощным общепатологическим фактором, индуцирующим развитие (и/или участвующим в развитии) целого ряда патологических процессов в различных органах и тканях. При этом речь, конечно, идет об эндотоксинах кишечной микрофлоры, мощным резервуаром которой является, толстая кишка.

В современных условиях все чаще возникают различные стрессовые ситуации, наблюдается практически повсеместное ухудшение экологического макро- и микроокружения, а также усиливается вредное воздействие различных физических и химических факторов, вследствие чего создаются условия для массивного проникновения эндотоксина в системный кровоток. Повторяющиеся (повторные) эндотоксиновые атаки могут лежать в основе развития иммунодефицитных состояний, иммунопатологии и других заболеваний человека.

В заключение, следует подчеркнуть, что изучение роли эндотоксина в физиологии и патологии человека заслуживает на наш взгляд серьезного внимания специалистов различного профиля, представителей фундаментальной медицинской науки и практического здравоохранения.

В ы в о д ы

1. Обнаружен феномен физиологической, системной эндотоксинемии: у практически здоровых людей разных возрастов (начиная с раннего периода новорожденности). В плазме крови в низких концентрациях определяется свободный эндотоксин (в концентрации 1.З6±0,10 пг/мл у новорожденных и 1.9±0,25 пг/мл у взрослых) и соответственно 4.20±1.15 и З.5±0.4% полиморфноядерных лейкоцитов крови несут на своей поверхности ЛПС.

2.0сновной эндотоксин-связывающей клеточной популяцией крови человека является полиморфноядерный лейкоцит. В физиолргических концентрациях ЛПС активирует адгезивную и фагоцитарную функции гранулоцитов. Наиболее выраженной способностью акцептировать эндотоксин обладает эозинофил.

З.Около 4.9% полиморфноядерных лейкоцитов практически здоровых людей обладает способностью к Fс-зависuмому связыванию эндотоксина in vitro при обработке мазков крови раствором, содержащим ЛПС, т.е. практически здоровые люди характеризуются наличием резерва связывания эндотоксина гранулоцитами крови.

4.По содержанию лейкоцитов, связывающих эндотоксин в организме обследуемого и в условиях in vitro, можно выделить 6 фаз состояния антиэндтоксинового иммунитета: 1-нормальное состояние, характерное для здоровых людей; 2-состояние активации иммунитета на фоне компенсированной системной эндотоксинемии; 3-состояние активации иммунитета на фоне декомпенсированной системной эндотоксинемии; 4-состояние истощения иммунитета; 5-состояние резкого угнетения иммунитета; 6-состояние восстановления иммунитета.

5.По показателям содержания антиэндотоксиновых IgG-антител(антител к гликолипиду Re) и антител к липополисахариду 014, содержащему общий антиген энтеробактерий, а также по соотношению между этими показателями, можно выделить 11 групп людей, характеризующихся различным уровнем состояния здоровья.

6.Состояние клеточного и гуморального антиэндотоксинового иммунитета коррелируют с общим состоянием здоровья обследуемых: 3,4,5 фазы клеточного иммунитета и 3,5,6,8 и 10 группы гуморального иммунитета характерны для лиц с различными острыми и хроническими заболеваниями, включая онкологические заболевания.

7.Гестозы, различные заболевания верхних дыхательных путей и легких, сердечно-сосудистая патология, заболевания мочеполовой системы, аппендициты и перитониты характеризуются снижением антиэндотоксинового иммунитета, повышенным содержанием эндотоксина в плазме крови и наличием ЛПС-перегруженных гранулоцитов.

8.Липополисахарид грамотрицательных бактерий является общепатологическим фактором, индуцирующим развитие (или по меньшей мере участвующим в механизме развития) различных патологических процессов, в том числе неинфекционного генеза. Патологическое действие эндотоксина, обусловливающее развитие различных видов органопатологии, реализуется в значительной мере через перегруженные (гиперактивированные) эндотоксином гранулоциты. ЛПС-перегруженные полиморфноядерные лейкоциты принимают непосредственное участие в патогенезе острого респираторного дистресс-синдрома, острого пиелонефрита, апппендицита. являются одной из причин эндотоксин-индуцированного повреждения эндотелиальных клеток сосудистый системы. Кроме того, гиперактивированные гранулоциты. по-видимому, могут быть одной из причин контрактурного повреждения кардиомиоцитов.

9. В механизмах удаления эндотоксина из системного кровотока и организма принимают участие легкие и почки. При экстремальной патологии ЛПС в больших количествах обнаруживается в эпителии проксимального отдела нефрона и может участвовать в патогенезе некронефроза. При экстремальных ситуациях вероятным представляется участие гранулоцитов в механизме выведения эндотоксина через почки, о чем свидетельствует наличие ЛПС-позитивных лейкоцитов в строме. Важная роль в удалении эндотоксина через легкие принадлежит гранулоцитам. В механизме выведения ЛПС-позитивных лейкоцитов принимают участие альвеолярные макрофаги. Обнаружена принципиальная возможность фагоцитоза жизнеспособных ЛПС-позитивных гранулоцитов альвеолярными макрофагами. Последние в еще большей степени чем лейкоциты подвержены токсическому воздействию эндотоксина. Фагоцитоз альвеолярными макрофагами ЛПС-перегруженных гранулоцитов; может быть одной из причин повреждения органа.

10. Транзиторной коронароспазм является одной из причин повреждения миокарда при экспериментальном эндотоксиновом шоке (генерализованный феномен Шварцмана на кроликах). Обнаружена принципиальная возможность развития инфаркта миокарда в результате транзиторного коронарос-пазма.

11. Разработаны новые иммунологические методы диагностики системной эндотоксинемии и оценки антиэндотоксинового иммунитета, необходимые для Диагностики системной эндотоксинемии и изучения роли эндотоксина в патогенезе важнейших заболеваний человека (инфекционного и неинфекционного генеза):

а) микромодификация теста с лизатом амебоцитов краба рода Limulus (микро-ЛАЛ-тест);

б) иммуноферментный и иммунофлюоресцентный методы выявления ЛПС-позитивных (эндотоксин-активированных) гранулоцитов(ЛПС-тест);

в) способ определения титров антиэндотоксиновых антител с помощью тонкослойного иммуного анализа (ТИА-антиэндотокс);

г) иммуноферментный способ, оценки резистентности организма (СОИС-ИФА) по показателям титров IgG-антител к гликолипиду Re-хемотипа и ЛПС 014 о общим антигеном энтеробактерий (СОИС-ИФА);

д) иммуноферментный способ оценки антиэндотоксинового иммунитета по наличию ЛПС-активированных лейкоцитов и резервного пула эндотоксин-чувствительных лейкоцитов.

12. Создана необходимая методическая база для создания основ патологоанатомической диагностики системной эндотоксинемии. эндотоксинового шока (методы прижизненной диагностики СЭЕ и идентификации ЛПС в органах и тканях) и изучения роли эндотоксина в патоморфогенезе различной органопатологии на секционном материале. Установлено, что облигатным признаком СЭЕ является системный маргинальный лейкостаз (преимущественно венулярного отдела) сосудистого русла. Патогномоничным признаком ЭШ является наличие ЛПС в некротизированном эпителии проксимального отдела нефрона и эндотоксин-позитивных (в том числе перегруженных) гранулоцитов с явлениями нейтрофильного альвеолита и др. проявлениями острого респираторного дистресс-синдрома.

13.Установлено, что вновь синтезированные производные альфа-имидазолилалкилсульфоновой кислоты обладают антиэндотоксиновой, противошоковой, дезагрегационной, а также антикоагуляционной и другими видами активности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Метаболическая гетерогенность миокарда и феномен централизации кровообращения в сердечной мышце при экспериментальном шоке// Материалы IX Всемирного конгресса кардиологов.-Москва.1981.-С.25-31.-М.Ю.Яковлев.

2. Метаболическая гетерогенность миокарда и феномен централизации кровообращения в сердечной мышце при эндотоксиновом шоке// Вестник АМН СССР.-1981.-N 5.-С.26-30. - М.Ю.Яковлев.

3. Cardiac coronary vessels in endotoxic shock// J.Mollec. and Cellul. Cardiol. 1983.-Vol.15.-Suppl.1.-P.49.- M.Yakovlev. A.Kubatiev.

4. Морфология миокарда при эндотоксиновом шоке// Арх.пат.-1985.-N 7 -С.34-41. - М.Ю.Яковлев.

5. Experimental endotoxic shock and its pharmacological correction// 1-st Vienna Shock Forum, 1-3 Mai 1986, Abstracts. - A.Kubatiev, S.Grachev, L.Smirnov. M.Yakovlev et al..

6. Иммуноморфологическая диагностика эндотоксинемии в акушерско-гинекологической практике// Сборник научных трудов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР,1987.-С.128-131. -В.Н.Серов, Е. В. Бондаренко. М.Ю.Яковлев и др.

7. Эндотоксиновый шок// Казанский мед. ж. -1987.-N 3.-С.207-211. -М.Ю.Яковлев.

8. Диагностическая информативность иммуноморфологической идентификации эндотоксин-положительных гранулоцитов в клинике и эксперименте//Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии: Тез.докл. II Всесоз.конФ.-Москва. 1987.-С.127-128. -М.Ю.Яковлев, А.Н. Круник, Е. В. Бондаренко и др..

9. Моделирование транзиторного коронароспазма в условиях острого опыта// Бюлл.экспер.биол.мед.-1987. -N 8. -С. 247-248. - А.Н.Крупник, М.Ю.Яковлев.

10. Ятрогения в урологии// Арх.пат.-1988.-N 5.-С.31-34.- Э.Н. Ситдыков, А. Н. Крупник, М.Э.Ситдыкова, М.Ю.Яковлев.

11. Роль кишечной микрофлоры и недостаточности барьерной функции печени в развитии эндотоксинемии и воспаления// Казанский мед. ж. -1988.-N 5.-С.353-358. - М.Ю.Яковлев.

12. Острый респираторный дистресс-синдром при эндотоксиновом шоке// Арх.пат.-1988.- N 11.-С. 81-89 - М.Ю.Яковлев, В.Н.Галанкин, А. И. Ипатов и др.

13. Взаимодействие эндотоксин-позитивных полиморфноядерных лейкоцитов с альвеолярными макрофагами ин витро// Тез.докл.-IX Всесоз. съезда патфизиологов,1989.-С.1236. - М.Ю. Яковлев, А.Н. Крупник, Л.Д. Зубаирова, А.А. Кубатиев.

14. Эндотоксин и система полиморфноядерного лейкоцита// Арх.пат. -1989.-N 5.-С.3-11. - Н.К.Пермяков, М.Ю.Яковлев, В.Н.Галанкин.

15. Эндотоксин-индуцированное повреждение легких// Тез.докл.- УШ Всесоюз.съезда патологоанатомов, 1989.-С.108-110. - М.Ю.Яковлев, А.Н.Крупник, Н.О. Крюков, Л.Д.Зубаирова.

16. 3озинофил - суперафинная клетка крови к эндотоксину// Бюлл. экспер. биол. мед.-1989. - N 6.-С.765-766. - М.Ю.Яковлев. А.А.Кубатиев, А.Н.Крупник. В. М. Бондаренко.Е.В.Суджан.

17. Острая почечная недостаточность (участие эндотоксина в патогенезе)// Пат. физ. экспер.тер.- 1989.-N 6.-С.77-80. - Н.К.Пермяков. М.Ю.Яковлев. В.В.Шляпников.

18. (Значение взаимодействия эндотоксина грамотрицательных бактерий и полимррфноядерных лейкоцитов для диагностики системной эндотоксинемии// Тез.докл. - 2 Всесоюз.конф. "Бактериальные токсины".- Юрмала, 1989. -С. 5. - А. В. Аполлонии. М.Ю.Яковлев. А. Н. Крупник и др.

19. Транзиторный коронароспазм в генезе инфаркта миокарда// Бюлл. экспер. биол. мед.-1989. - N 7.-С. 121-123. - Н.К.Пермяков. М.Ю.Яковлев. А. Н Крупник, А.А.Кубатиев.

20. Эндотоксин кишечной микрофлоры в патологии печени// Арх.пат. -1989.- N 9.-С. 3-9. - Н.К.Пермяков. М.Ю.Яковлев, А.А.Миронюк.

21. Диагностика и терапия эндотоксинового шока// Хирургия. Экспресс-информация НПО"Союзмединформ".-1989.-Выпуск 3.-С. 14-27. - В.Н. Серов, Н. В. Аныкина, М.Ю. Яковлег. и др..

22. Патология органов пищеварения и системная эндотоксинемия// Арх. пат. -1989.- N 12.-С. 74-79. - Н. К. Пермяков. М.Ю.Яковлев.

23. Дипополисахарид микрофлоры кишечника в физиологии и патологии системы полиморфноядерного лейкоцита// Сборник научных трудов НИИ морфологии человека АМН СССР. -М. . 1989. -С. 74-77. - М. Ю. Яковлев. В.Н. Таланкин, A.H. Крупник, А. М. Токмаков.

24. Системная эндотоксинемия и бронхообструктивный синдром при острой респираторной вирусной инфекции у детей// Там же. -С. 8-11. М.Ю.Яковлев, В. А. Анохин, Г. Р. Булатова и др.

25. Системная эндотоксинемия при различных формах острого аппендицита// Там же.- С. 17-19. - М.Ю.Яковлев. А.А.Рудик, С.С.Федотов и др.

26. Сердце при эндотоксиновом шоке// Пат.физ.и экспер.тер.- 1990. - N 2, С|45-48. - Н.К.Пермяков. М.Ю.Яковлев.

27. Эндотоксинсвязывающие системы крови// ЖМЭИ. - 1990. - N 11.-С.100-106. - А.В. Аполлонии, М.Ю. Яковлев. А.А. Рудик, В.Г. Лиходед.

28. “2-Имидазолил... - сульфокислота, обладающий иммуностимулирующей, антиагрегационной. дезагрегационной активностью и усиливающая сократительную активность скелетных мышц”// Авторское свидетельство N 1644475 6т 22 декабря 1990 г.. ДСП экз. N 000132. - В. Б. Иванов. М.Ю.Яковлев. О.К.Поздеев и др.

29. "Производные альфа-... сульфоновой кислоты, обладающие противошоковой антиагрегационной и дезагригационной активностью, усиливающие сократительную активность скелетных мышц и способ их получения"// Авторское свидетельство N 1665676 от 22 марта 1991 г., ДСП экз. N 000147. - М.Ю.Яковлев, В.Б.Иванов, О.К.Поздеев и др.

30. "Basic mechanisms of the DIC-syndrome development in pases of system endotoxemia and endotoxic shock" // Abstracts of the constituent Congvess of the International Society for pathophysiology. Moscow. 1991. p.125. -A.Kuhatiev, S.Grachev, L.Smirnov, M.Yakovlev et al.

31. Альвеолярные макрофаги в физиологии и патологии легких.// Арх.пат. - 1991. -N 4. -С.3-8. -М.Ю.Яковлев. Л.Д.Зубаирова, А.Н.Крупник, Н.К.Пермяков.

32. Эндотоксинемия в раннем периоде адаптации новорожденных и их матерей// Казанский мед.ж.- 1992.-N2.- С. 114-118. - Р.А.Уразаев, А.Н.Крупник, М.Ю.Яковлев.

33. "Способ обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий"// Авторское свидетельство N 1749758 от 22 марта 1992 г.- М.Ю.Яковлев, А.Н.Крупник, В.Г.Лиходед, В.М.Бондаренко и др.

34. "Способ оценки резистентности организма по В-звену гуморального антиэндотоксинового иммунитета" // Заявка на патент. Приоритетная справка N 5050728, положительное решение от 29 сентября 1992. Р.А.Уразаев, А.И.Аниховская, М.Ю.Яковлев и др.

35. Эндотоксинемия и синдром бронхиальной обструкции при респираторных вирусных инфекций у детей.-Казанский мед.ж.-1993.-1.-С.21-24. - Г. Р. Хасанова, В. А. Анохин, Р. А. Уразаев, М. Ю. Яковлев.

36. "Способ оценки иммунитета к эндотоксинам грамотрицательных бактерий ("ЛПС-ТЕСТ-ИФА")". Заявка па патент. Приоритетная справка N 93039852 от 04 августа 1993 г. - А.В. Аполлонии, В.Г.Лиходед. Н.Д. Ющук, М.Ю.Яковлев и др.

37. Содержание TNF в крови у больных с разлитым перитонитом при проведении интракорпоральной детоксикации.// Сборник трудов НИИ морфологии человека РАМН.-1993. - В печати. - В. В. Струсов, Ш. С. Каратай, Н. Н. Лустина, М. Ю. Яковлев.

38. Экстракорпоральная терапия эндотоксикоза при разлитом перитоните.// Там же. - Ш.С.Каратай, Н. Н. Лустина, В. В. Струсов. М.Ю.Яковлев.

39. Антиэндотоксиновый иммунитет при воспалительных заболеваниях половых органов.// Там же.- В.Н. Серов, Л.Н. Ильенко, С.Н. Сидоров Р.А. Уразаев, М.Ю.Яковлев.