В. М. Бондаренко, В.Г.Лиходед, М.Ю.Яковлев

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Институт общей и клинической патологии, Москва

Полученные в последние годы новые данные о важной роли липополисахаридов (эндотоксина) грамотрицательных бактерий в физиологии и патогенезе важнейших заболеваний человека, как инфекционного, так и неинфекционного генеза, определяют необходимость широких клинических испытаний самых различных методов обнаружения ЛПС в крови и других биологических жидкостях. Из имеющихся на сегодняшний день методов диагностики эндотоксинемии применение находит высокочувствительный ЛАЛ-тест в самых разнообразных модификациях. Известна неспецифичность ЛАЛ-теста, многие недостатки которого успешно преодолены. Приведенные результаты клинических исследований по определению активности ЛПС в системном кровотоке и титров антител к его наиболее общим детерминантам, а также резервы связывания эндотоксина гранулоцитами позволяют с оптимизмом оценивать перспективу дальнейшего изучения роли ЛПС в физиологии и патологии человека. В клинической практике необходимо учитывать как положительные моменты, так и недостатки при применении известных в настоящее время методов определения ЛПС, в том числе и ЛАЛ-теста, для комплексной оценки показателей эндотоксинемии.

Ключевые слова: липополисахариды, эндотоксины, грамотрицательные бактерии, методы определения, физиологическая эндотоксинемия

DETECTION OF THE ENDOTOXIN OF GRAM NEGATIVE BACTERIA IN HUMAN BLOOD

V.M. Bondarenko, V.G. Likhoded, М. Yu. Yakovlev

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Institute of General and Clinical Pathology, Moscow, Russia

Recent new data on the important role played by lipopolysaccharides (endotoxin) of Gram negative bacteria in physiology and pathogenesis of the most important human infectious and noninfectious diseases testify to the necessity of wide clinical trials of different methods for LPS detection in blood and other physiological fluids. Among presently available diagnostic methods for endotoxinemia detection, the highly sensitive LAL (Limulus Amebo-cyte Lysate) test in various modifications is most widely used. The LAL test is known to be nonspecific, however many drawbacks of this test have been successfully overcome. The results of clinical studies on the determination of the LPS activity in the systemic blood stream and antibody titers to its most common determinants, as well as the reserves of endotoxin binding with granulocytes give grounds for optimistic evaluation of the future studies on the role of LPS in human physiology and pathology. In clinical practice both positive sides and drawbacks of the presently known methods for LPS detection, including the LAL test, must be borne in mind for the complex evaluation of endotoxinemia levels.

Key words: lipopolysaccharides, endotoxins, Gram negative bacteria, detection methods, physiological endotoxinemia

Эндотоксином (ЭТ) называют липополисахарид (ЛПС) внешней мембраны клеточной стенки грамотрицательных (Гр) бактерий. В отличие от экзотоксинов ЛПС выделяется во внешнюю среду в основном при разрушении бактериальных клеток. Существует также свободный эндотоксин, продуцируемый бактериями во внешнюю среду и обнаруживаемый в супернатантах бульонных культур. Однако его количество сравнительно невелико.

Эндотоксину посвящено огромное количество публикаций, включающих экспериментальные исследования, клинические наблюдения, обзоры и монографии. В частности, в 1984 г. издано 4-томное руководство по эндотоксинам [23], а в 1999 г. вышел в свет сборник "Endotoxin in Health and Disease", содержащий 64 раздела публикаций обзорного типа ведущих специалистов по различным аспектам структуры, биосинтеза, биологической активности и роли эндотоксина в физиологии и патологии человека [20]. В 1988 г. создано Международное эндотоксиновое общество, которое в 1994 г. основало Journal of Endotoxin Research и провело уже 6 международных конференций, посвященных рассмотрению новых достижений в области эндотоксинологии.

Большой интерес исследователей к ЭТ обусловлен не только его уникальной структурой и весьма широкой по разнообразию вызываемых эффектов биологической активностью, но и тем обстоятельством, что человек находится в постоянном контакте с ЭТ, так как в его кишечнике обитает довольно большое количество грамотрицательных бактерий.

Сравнительно недавно при помощи иммунофлюоресцентного метода было впервые показано, что ЭТ может быть обнаружен на поверхности гранулоцитов в крови новорожденных, их матерей и других практически здоровых людей [11, 17]. Применение иммуноэнзимной технологии позволило затем показать, что в тонких мазках крови здоровых людей обнаруживается около 3% полиморфноядерных лейкоцитов, связавших эндотоксин в кровотоке обследуемых при помощи Fc-зависимого механизма. Кроме того, еще около 5% лейкоцитов способны связывать эндотоксин in vitro, то есть у здоровых людей имеются резервы связывания эндотоксина лейкоцитами [5, 6]. ЭТ был обнаружен также в плазме крови. практически здоровых людей [31, 35]. E.T. Rietschel и O. Westphal [40] полагают, что эндотоксин может играть определенную роль в физиологии человека, и приводят расчетные данные о том, что каждый человек постоянно контактирует с грамовыми количествами эндотоксина, и в его плазме крови содержится примерно 3-10 пкг эндотоксина в мл. Более детально вопрос о роли эндотоксина в физиологии и патологии человека рассматривается в публикациях отечественных исследователей, которые полагают, что в норме у человека проникновение низких доз ЭТ приводит к развитию системной эндотоксинемии, которая обеспечивает поддержание всех частей иммунной системы в состоянии физиологического тонуса и адаптацию макроорганизма к изменяющимся условиям [16, 17]. При стрессовых состояниях и различных заболеваниях может наблюдаться увеличенное поступление ЭТ в кровоток и снижение антиэндотоксинового иммунитета, что приводит к развитию эндотоксиновой агрессии, то есть к проявлению патогенного действия ЭТ [18].

Эти положения находят свое подтверждение во многих работах, в которых показано снижение антиэндотоксинового иммунитета и участие ЭТ в патогенезе различных инфекционных и неинфекционных заболеваний, таких как гестозы, эклампсия, острые вирусные респираторные заболевания, гепатиты, атеросклероз и инфаркт миокарда, сепсис и многие другие [1, 2, 4, 8, 9, 13, 14, 22, 27, 28, 49].

Эти материалы указывают на очевидную целесообразность диагностики эндотоксинемии при различных видах патологии. К сожалению, диагностика эндотоксинемии в наших учреждениях проводится очень редко. В связи с этим, необходимо коротко рассмотреть и оценить известные методы обнаружения ЭТ в кровотоке. В принципе для обнаружения ЭТ могут быть использованы методы, основанные на выявлении уникальных структурных компанентов ЛПС (1), иммунологические методы (2), способы с использованием веществ, связывающих ЛПС (3) и методы, основанные на выявлении биологической активности ЭТ (4).

Методы обнаружения ЭТ, основанные на выявлении его уникальных структурных компонентов. В этом разделе необходимо отметить, прежде всего, возможность использования таких уникальных компонентов ЛПС как β-гидроксимиристиновая кислота и КДО — кетодезоксиоктулозоновая кислота в качестве химических маркеров, позволяющих определить присутствие и количество ЭТ. Для выявления и оценки количества β-гидроксимиристиновой кислоты были использованы такие трудоемкие методы как выделение и гидролиз ЛПС, газ-хроматография и масс-спектрометрия [33,34]. Наличие и количество КДО может быть определено тиобарбитуровым методом или при помощи спин-резонанса также после выделения ЛПС [30,46,48]. Несмотря на достаточно высокую точность определений, все эти методы практически не применимы в рутинных лабораторно-клинических исследованиях [3, 9].

Иммунологические методы обнаружения ЭТ. В принципе, ЛПС является хорошим антигеном и вызывает обычно формирование нескольких классов антител в достаточно высоких титрах. Однако ЭТ обычно используют для выявления антиэндотоксиновых антител, в то же время прямое определение ЭТ при помощи антител характеризуется низкой чувствительностью, не позволяющей выявлять концентрации ЛПС менее 0,1 мкг/мл [6, 21, 29, 37]. Тем не менее, иммунологические методы могут быть использованы в комбинации с другими приемами. Один из таких методов включает использование мышиных моноклональных антител класса IgM против липида А. При добавлении этих антител к цельной крови, содержащей ЛПС, формируется комплекс антитело-эндотоксин, который, взаимодействуя с рецепторами нейтрофилов, связывает комплемент, опсонизированный зимозаном, и индуцирует продукцию нейтрофилами оксиданта, вызывающего окисление люминала и последующую эмиссию света, то есть люминолзависимую люминесценцию. Успешность воспроизведения этой реакции зависит от оптимального соотношения антител и ЭТ. Для количественного определения ЭТ этим методом необходимо проведение позитивного контроля с определенным соотношением ЛПС и антител. Результаты определения ЭТ этим методом были хорошо воспроизводимы при концентрации ЛПС 0,017 — 1,6 EU/ мл или 20 — 2000 пкг/мл, то есть метод характеризуется достаточно высокой чувствительностью [41].

Способы обнаружения с использованием веществ, связывающих ЭТ. Известно, что антибиотик полимиксин В обладает выраженной способностью связывать ЛПС, и эта способность была использована для разработки методов выявления ЭТ [43,45]. В частности, был приготовлен конъюгат Fab-фрагментов антител к гликофорину эритроцитов (SimpliRED Endotoxin Test), которые связываются с поверхностными структурами эритроцитов, но не вызывают гемагглютинацию. Однако если в крови присутствует ЭТ, он связывается с фиксированными на эритроцитах конъюгированными антителами и обусловливает тем самым развитие хорошо выраженной гемагглютинации [32, 45]. SimpliRED-тест характеризуется довольно высокой чувствительностью (1,2 EU/мл).

Другим примером из этой области является использование белка, нейтрализующего ЭТ (ENP). Этот белок, выделенный из лизата амебоцитов краба рода Limulus, обладает высоким сродством к ЛПС. Полученный методами молекулярной биотехнологии рекомбинантный белок rENP был помечен флюоресцентом и затем использован в приборе PolarScan для количественного определения ЭТ по изменению поляризации флюоресценции [44]. Используя стандартную кривую с очищенным ЭТ, авторы определили, что способ воспроизводимо выявляет ЭТ при его содержании не менее 5 EU/мл. Возможности широкого использования метода ограничены необходимостью выделения и очистки белка ENP, использования прибора PolarScan, а также необходимостью обработки исследуемых образцов ультразвуком для дезагрегации ЭТ и более точного его определения.

Для выявления ЭТ могут быть использованы и некоторые другие белки, обладающие сродством к ЛПС [36].

Определение ЭТ по выявлению его биологической активности. Наиболее известным и широко используемым в фармации является так называемый пирогенный тест, основанный на способности ЭТ при внутривенном введении вызывать у кроликов температурную реакцию. Хотя этот тест может быть использован для количественного определения ЛПС [50], однако его достаточно высокая стоимость, необходимость строгого контроля за животными и возможная вариабельность их ответа затрудняют его применение в клинической лабораторной практике.

Недавно описан новый пирогенный тест, в котором используется цельная кровь здоровых доноров [24]. При инкубации пробы этой крови с исследуемым образцом, содержащим пироген, в лейкоцитах индуцируется синтез интерлейкина-1, наличие которого выявляется иммуноэнзимным способом. Способ, однако, выявляет не только ЭТ, но и некоторые другие биологически активные полимеры.

Способ количественного определения ЭТ по гибели животных характеризуется низкой чувствительностью [38] и также мало пригоден для использования в диагностике. Возможны также способы определения ЭТ по его способности вызывать у чувствительных животных определенные изменения, например, повышать содержание в плазме крови некоторых белков острой фазы, в частности, сывороточного амилоида [39]. Применение таких методов также крайне ограничено.

Более перспективны методы, основанные на оценке различных биологических эффектов, вызываемых ЭТ в культурах клеток человека, например, макрофагов, лейкоцитов, моноцитов периферической крови [36]. Плохая воспроизводимость этих методов ограничивает пока возможности их диагностического применения. Более воспроизводим недавно предложенный метод определения ЛПС путем измерения продукции NO в макрофагах мыши линии RAW [25]. Метод довольно чувствителен, однако до сих пор в диагностической практике не применялся.

Наиболее широкое применение в практике выявления ЭТ нашел тест с лизатом амебоцитов краба Limulus poliphemus — Limulus Amebocyte Lysate (LAL). Этот так называемый LAL-тест основан на способности ЭТ вызывать коагуляцию некоторых белков, содержащихся в лизате амебоцитов [35]. Он широко применяется для обнаружения ЭТ в фармацевтической практике и с этой целью включен в фармакопеи целого ряда стран, в том числе и в фармакопею Российской Федерации [10]. LAL-тест характеризуется очень высокой чувствительностью (5 пкг/мл или 0,06 EU/ мл, 1 нг = 12 Endotoxin Units) [19], а его так называемая хромогенная модификация еще более чувствительна (0,001 — 0,005 EU/мл) [30]. В связи с этим, возможность применения LAL-теста в диагностике привлекала и привлекает повышенное внимание многих исследователей [26 — 28, 35]. Тем не менее, официальное использование LAL-теста в клинической практике до настоящего времени разрешено только в Японии, хотя этот метод был применен в целом ряде исследований и довольно интенсивно обсуждается [26 — 28,31,35].

В чем же причины отсутствия официального признания LAL-теста как метода диагностики эндотоксинемии? Это объясняется, прежде всего, наличием довольно сложных взаимоотношений между ЭТ, LAL и компонентами крови человека. Поступая в кровоток, ЭТ может взаимодействовать со многими клетками крови и компонентами плазмы крови, включая различные лейкоциты, тромбоциты, соли желчных кислот, различные протеины и липопротеины. Эти взаимодействия могут давать прямо противоположные результаты. Связывание ЭТ с лейкоцитами и тромбоцитами, с антителами и липопротеинами высокой удельной плотности, с белком LBP, связывающим ЛПС (LPS binding protein), или с бактерицидным белком BPI (bactericidal/permeability increasing protein), увеличивающим проницаемость бактериальной клетки, может приводить к уменьшению показателей реакции в LAL-тесте. Такой же эффект дает взаимодействие ЭТ с гепарином. Наоборот, взаимодействие с солями жирных кислот может способствовать дезагрегации частиц ЛПС и, в конечном итоге, увеличению показателей LAL-теста. На показатели LAL-теста может серьезно влиять также контаминация лабораторной посуды и реактивов некоторыми экзогенными продуктами бактерий и грибов (ЛПС и глюканами), которые также увеличивают показатели LAL-теста. Правда, глюканы грибов реагируют с LAL в значительно более высоких концентрациях, чем ЛПС.

Обобщая изложенное выше, необходимо отметить возможное наличие в крови или в посуде и реагентах факторов, ингибирующих или активирующих реакцию ЭТ с LAL. Поэтому при постановке LAL-теста для получения более точных результатов необходимо обеспечить: 1) высвобождение связанного ЭТ, 2) инактивацию компонентов, позитивно или отрицательно влияющих на показатели реакции путем разведения, прогревания или обработки перхлористой кислотой, 3) концентрацию ЭТ и других факторов, например, дивалентных катионов, оптимальную для реакции ЭТ с LAL. При этом нужно учитывать, что некоторые антибиотики, в частности, аминогликозиды и пенициллин также интерферируют с LAL-тестом [44]. Детально техника обработки образцов и постановки реакции с LAL описана в ряде публикаций [27, 35, 41, 42, 47].

При анализе результатов LAL-теста следует иметь также в виду возможную индивидуальную вариабельность в количественном содержании ингибирующих и активирующих факторов у различных пациентов и в различных лабораторных условиях. Коэффициент вариабельности результатов теста достаточно высок (около 50%). Кроме того, количественные результаты LAL-теста определяются путем сравнения со стандартной кривой, полученной при использовании референс-эндотоксина, например ЛПС Escherichia coli, однако эндотоксины разных видов бактерий (например, ЛПС сальмонелл и ЛПС псевдомонад) обладают различной способностью активировать компоненты лизата амебоцитов.

Авторы [19, 22, 26 - 28, 35, 37, 38], подвергавшие анализу результаты применения LAL-теста в клинике, делают заключение о необходимости осторожной интерпретации данных, полученных при помощи LAL-теста, так как нет строгой корреляции между содержанием ЭТ в крови и тяжестью клинических явлений, а также с прогнозом дальнейшего развития заболеваний. В связи с этим необходимо обратить внимание на одностороннюю оценку роли показателей эндотоксинемии в клинических Исследованиях. Практически во всех работах зарубежные авторы учитывали только показатели эндотоксинемии и не принимали во внимание, даже не изучали показатели антиэндотоксинового иммунитета. В то же время наши данные свидетельствуют о том, что показатели антиэндотоксинового иммунитета играют очень важную роль при самых различных заболеваниях [1, 4, 6, 13, 18]. Тяжесть клинического течения и прогноз развития заболеваний, безусловно, зависят от соотношений между показателями эндотоксинемии и состоянием антиэндотоксинового иммунитета. Поэтому правильная оценка роли эндотоксинемии возможна только при одновременном определении показателей и эндотоксинемии и антиэндотоксинового иммунитета.

Изучение материалов литературы и собственных исследований позволяет сделать заключение, что для диагностики эндотоксинемии в настоящее время наиболее широкое применение нашел высокочувствительный LAL-тест, хотя он и обладает рядом недостатков. Вместе с тем, более широкому изучению подлежат и некоторые новые тесты, например SimpliRED Endotoxin Test [43] и тест с использованием люминолзависимой люминесценции при добавлении к цельной крови антител к липиду А [41].

ЛИТЕРАТУРА

1. Анохин В.А., Бондаренко В.М., Уразаев Р.А. и др. Гуморальный иммунный ответ к антигенам транзиторной кишечной аутофлоры при острых респираторных вирусных инфекциях у детей. Журн. микробиол. 1994, 6:41 — 43.

2. Аполлонин А.В., Рудик А.А., Кропачева Е.И. и др. Динамика титров антител к Re-гликолипиду у пациентов с перитонитом в процессе антиэндотоксиновой терапии. Там же: 88 - 89.

3. Денисова Л.Я., Батурина И.И., Закабунин А.И. и др. Определение примесей липополисахаридов в препаратах белков. Там же. 1999,5: 109- 112.

4. Дмитриева Е.В., Аполлонии А.В., Лиходед В.Г. и др. Функциональная активность антиэндотоксиновых факторов при вирусных гепатитах А и В. Вестн. РАМН. 1995, 12: 38 -41.

5. Лиходед В.Г., Аниховская И.А., Аполлонин А.В. и др. Fc-зависимое связывание эндотоксинов грамотрицательных бактерий полиморфноядерными лейкоцитами крови человека. Журн. микробиол. 1996, 6: 76 — 79.

6. Лиходед В.Г., Яковлев М.Ю., Аполлонии А.В. и др. Способ оценки антиэндотоксинового иммунитета относительно грамотрицательных бактерий (ЛПС-тест-ИФА). Патент РФ № 2088936, 1997.

7. Лиходед В.Г., Чхаидзе И.Г., Галдавадзе М.А. и др. Развитие кишечного дисбактериоза у новорожденных детей при недостаточности антител к Re-гликолипиду. Журн. микробиол. 1998,4:67-68.

8. Лиходед В.Г., Яковлев М.Ю., Мосежный А.Е. и др. Антиэндотоксиновый иммунитет в физиологии и патологии человека. Мед. экстремальных ситуаций. 1999, 1: 22 — 26.

9. Лыкова Е.А., Бондаренко В.М., Воробьев А.А. и др. Бактериальная эндотоксинемия у
детей при кишечных дисбактериозах. Журн. микробиол. 1999, 3: 67 — 70.

10. Общая фармакопейная статья ОФС 42-0002-00.Бактериальные эндотоксины.

11. Серов В.Н., Бондаренко Е.В., Яковлев М.Ю. и др. Иммуноморфологическая диагностика эндотоксинемии в акушерской и гинекологической практике. Труды НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи. М., 1987, с. 128- 131.

12. Таболин В.А., Бельчик Ю.Ф.,ЧабаидзеЖЛ. и др. Показатели антиэндотоксинового иммунитета у новорожденных в норме и патологии. Международн. журн. иммунореабил. 2000, 1: 131- 137.

13. Уразаев Р.А., Крупник А.А., Яковлев М.Ю. Эндотоксинемия в раннем периоде адаптации новорожденных и их матерей. Казан, мед. журн. 1992,2: 114 - 118.

14. Уразаев Р.А., Яковлев М.Ю., Аниховская И.А. и др. Способ оценки резистентности организма (SOIS-IFA). Патент РФ №2011913,1994.

15. Ющук Н.Д., Лиходед В.Г., Яковлев М.Ю. и др. Титры антител к гликолипиду хемотипа Re и связывание эндотоксина лейкоцитами при гнойных менингитах. Журн. микробиол. 1996, 6:52-53.

16. Яковлев М.Ю. Роль кишечной микрофлоры и недостаточности барьерной функции печени в развитии эндотоксинемии и воспаления. Казан, мед. журн. 1988, 5: 353 — 358.

17. Яковлев М.Ю., Лиходед В.Г., Крупник А.А. и др. Способ обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий. А.с. № 1749758, 1992.

18. Яковлев М.Ю., Лиходед В.Г., Аниховская И.А. и др. Использование показателей антиэндотоксинового иммунитета для объективной оценки резистентности организма и эффективности терапии. Мед. журн. России. 1998,2: 139 - 143.

19. Cohen J. The detection and interpretation of endotoxemia. Intens. Care Med. 2000,26 (sup-pl.I): 51 — 56.

20. Endotoxin in Health and Disease. H. Brade et al. (ed.). N.Y.-Basel, 1999.

21. Fink P.C., Galanos C. Determination of anti-lipid A and lipid A by enzyme immunoassay. Immunobiology. 1981, 158: 380 - 390.

22. Fink M.P., Mythen M.G. The role of gut-derived endotoxin in the pathogenesis of multiple organ dysfunction. In: Endotoxin in Health and Disease. H. Brade et al; (ed.). N.Y.-Basel, 1999, p. 855 - 864.

23. Handbook of endotoxin. R. Proktoret al. (ed.). Elsevier Press, Amsterdam-New-York-Oxford, 1984.

24. Hartung Т., Fennrich S., Wendel A. Detection of endotoxin and other pyrogens by human whole blood. J. Endotox. Res. 2000,6 (2): 184.

25. Hitchins V.M., Neale A.R., Merritt K. Detection of lipopolysaccharide by measuring nitric acid production in murine macrophage cells. Ibid: 101 - 102.

26. Hurley J.C. Concordance of endotoxemia with gram-negative bacteria in patients with gramnegative sepsis: a meta-analysis. J. Clin. Microbiol. 1994,32:2120-2127.

27. Hurley J.C. Endotoxemia: methods of detection and clinical correlates. Clin. Microbiol. Rev. 1995, 8: 268 - 292.

28. Hurley J.C, Levin J. The relevance endotoxin detection in sepsis. In: Endotoxin in Health and Disease. H. Brade et al. (ed.). N.Y.-Basel, 1999, p. 841-854.

29. Gutowski J.A., Jacobs D.M. A solid phase radioimmunoassay for bacterial lipopolysaccharide. Immunol. Commun. 1979, 8: 347 - 364.

30. Karkhanis Y.D., Zeltner J.Y., Jackson J.J. et al. A new and improved microassay to determine 2-keto-3-desoxyoctonate in lipopolysaccharide of gram-negative bacteria. Annal. Bi-ochem. 1978,85:595-601.

31. Ketchum P.A., Parsonnet J., Stotts L.S. et al. Utilization of a chromogenic Limulus amebocyte lysate blood assay in a multi-center study of sepsis. J. Endotox. Res. 1997, 4: 9 — 16.

32. Koleff M.H., Eisenberg P.R. A rapid qualitative assay to detect circulating endotoxin can predict the development of multiorgan dysfunction. Chest. 1997, 112(1): 173- 180.

33. Maitra S.K., Schotz M.C., Yoshikawa T.T. et al. Determination of lipid A and endotoxin in serum by mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978, 75: 3993 - 3997.

34. Maitra S.K., Nachum R., Pearson F.C. Establishment of meta-hydroxy fatty acids as a chemical marker molecules for bacteria endotoxin by gas chromatography-mass spectrometry. Appl. Environ. Microbiol. 1986, 52: 510 — 514.

35. Novitsky T.J. Limulus amebocyte lysate (LAL) detection of endotoxin in human blood. J. Endotox. Res. 1994, 1:253-263.

36. NovitskyT.J. Endotoxin detection in body fluids: Chemical versus bioassay methodology. In: Endotoxin in Health and Disease. H. Brade et al. (ed.). N.Y.-Basel, 1999, p. 831 - 839.

37. Pedron Т., Girard R., Kosma P. et al. Preparation and binding specifity of a monoclonal antibody recognizing-3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid (KDO) in lipopptysaccharides of Re chemotype. Hibridoma.1992, 11:765 — 777.

38. Pieroni R.E., Broderick E.J., Bundeally A. et al. A simple method for the quantitation of sub-microgram amounts of bacterial endotoxin. Proc. Soc. Exp. Med. 1970, 133: 790 - 794.

39. Poole S., Gaines Das R.E., Baltz M. et al. Detection of endotoxin in mice by measurement of endotoxin-induced changes in plasma concentration of zinc and of the acute-phase protein serum amyloid P-component. J. Pharm. Pharmacol. 1986, 38: 807 - 810.

40. Rietschel E., Westphal O. Endotoxin: historical perspectives. In: Endotoxin in Health and Disease. H. Brade et al. (ed.). N.Y.-Basel, 1999, p. 1 - 30.

41. Romashin A.D., Harris D.M., Ribeiro M.B. et al. A rapid assay of endotoxin using autologous neutrophil dependent chemiluminescence. J. Immunol. Method. 1998, 212 (2): 169 - 185.

42. Roth R.I., Levin F.C, Levin J. Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with Limulus test. J. Lab. Clin. Med. 1990,116: 153- 161.

43. Rylatt D., Wilsin K., Kemp B.E. et al. A rapid test for endotoxin in whole blood. In: Bacteria Endotoxin: Lipopolysaccharides from Genes to Therapy. New York, Wiley-Liss, Inc., 1995, p. 273 - 284.

44. Sloyer J., Novitsky T. Use of rENP to quantitate endotoxin by fluorescence polarisation. J. Endotox. Res. 2000, 6 (2): 101.

45. Smith N.L. A field test for endotoxin in the horse. Vet. Rev. 1993, 13: 433 - 440.

46. Strain S.M., Armitage I.M. Selective detection of 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid in intact lipopolysaccharides by spin-echo NMR. J. Biol. Chem. 1985, 260: 12974 - 12977.

47. Sullivan J.D., Watson S.W. Inhibitory effect of heparin on the limulus test of endotoxin. J. Clin. Microbiol. 1975, 2: 151-155.

48. Unger F.M. The chemistry and biological singificance of 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid (KDO). Advanc. Carbohydr. Chem. Biochem. 1981,38:323-387.

49. Wiederman C.J., Kiechl S., Dunzendorfer S. et al. Endotoxin and atherosclerosis. J. Endotox. Res. 2000, 6 (2): 86.

50. Wolf S.M., Mulholland J.H., Ward S.B. Quantitative aspects of the pyrogenic response of rabbit to endotoxin. J. Labor. Clin. Res. 1965, 65: 268 - 275.

Поступила 30.06.01