Казанский мед

В раннем периоде адаптации у всех новорожденных при формировании аутофлоры развивается транзиторный дисбактериоз, связанный с колонизацией респираторного и кишечного тракта, условно-патогенными микроорганизмами, в частности энтеробактериями (эшерихиями, клебсиеллами, энтеробактером) и золотистыми стафилококками [5]. Нарушение микроэкологии сопровождается гибелью антагонистически активных бактерий и развитием токсинемии с потреблением специфических антител, что может привести к снижению резистентности к инфекциям, особенно грамотрицательной этиологии [8]. Патогенный эффект возбудителей этих заболеваний обусловлен высвобождающимся из микробов эндотоксином [15]. При системной эндотоксинемии развиваются гипогликемия и ацидоз, нарушаются терморегуляция, деятельность ЦНС, желудочно-кишечного тракта и функция почек [14]. Изменения в указанных органах и системах, отражающие процесс адаптации, часто наблюдаются в периоде новорожденности. На возможную этиологическую роль эндотоксина в развитии некоторых пограничных состояний у новорожденных указывают ряд авторов [3, 5, 6]. Однако в литературе нет каких-либо конкретных данных о содержании эндотоксина у новорожденных в первые дни жизни и специфических защитных реакциях в ответ на антигенную стимуляцию.

Состояние антиэндотоксинового иммунитета можно оценивать по содержанию антител к гликолипиду Re-мутантов энтеробактерий. Гликолипид хемотипа Re, состоящий из липида А и трех молекул кетодезоксиоктановой кислоты, является обязательным компонентом липополисахарида внешней мембраны большинства грамотрицательных бактерий и может служить в качестве маркера эндотоксина [1, 14].

Целью исследований было установление взаимосвязи между развитием адаптационных реакций в раннем неонатальном периоде и содержанием в плазме новорожденных и их матерей эндотоксина и антител к Re-гликолипиду энтеробактерий. Для оценки состояния иммунной системы определяли титр антител против кишечной палочки и золотистого стафилококка.

Под наблюдением находились 38 доношенных новорожденных и 37 матерей. При группировке клинического материала учитывали состояние здоровья детей при рождении и характер течения периода ранней адаптации. В 1-ю контрольную группу вошел 21 новорожденный с оценкой состояния по шкале Апгар в 8—9 баллов, с массой тела от 3000 до 5000 г. К груди детей прикладывали на 1—2-е сутки, и они были выписаны домой на 4—6-й день (5,0±0,1). Ранний неонатальный период протекал без осложнений. Матери здоровых новорожденных были включены в 4-ю группу. Все они, за исключением одной женщины с хроническим бронхитом, были здоровы; беременность и роды у 18 женщин протекали физиологически, у 3 — осложнились анемией, токсикозом беременных и слабостью родовой деятельности. Во 2-ю группу вошли 6 здоровых детей (оценка по шкале Апгар —7—8 баллов, через 5 мин — 8—9 баллов), с различными реакциями адаптации (физиологическая диспепсия — у 4, токсическая эритема — у 2), которые были купированы к моменту выписки домой на 4—6-й день (5,1±0,4). Матери этих детей составили 5-ю группу. Из них одна женщина перенесла пиелонефрит, у 2 — произошло преждевременное отхождение вод. В 3-ю группу вошли 11 новорожденных с явлениями дезадаптации гипоксически-травматического генеза. Асфиксию средней тяжести перенесли 8 детей, внутриутробную гипоксию —3. При рождении оценка по шкале Апгар в 4—5 баллов была дана 2 детям, в 6— 7 баллов —9. 4 ребенка родились в состоянии гипотрофии I степени, 2 — с признаками незрелости, один — путем кесарева сечения. У 8 новорожденных в первые дни жизни отмечались клинические проявления нарушения мозгового кровообращения I—II степени, у 2 — вегетовисцеральных дисфункций. На 3—5-й день жизни состояние детей в основном стабилизировалось, лишь в отдельных случаях имели место умеренный акроцианоз, мышечная дистония, гипорефлексия, срыгивания и неустойчивость стула. Все дети после соответствующего лечения были выписаны домой на 5— 9-й день (7,1 ±0,5). Матери новорожденных были включены в 6-ю группу. У 10 из 11 женщин течение беременности и родов было осложнено вегето-сосудистой дистонией (2), анемией (1), токсикозом беременных (2), преждевременным отхождением вод (7), слабостью родовой деятельности (1).

Содержание эндотоксина изучено у 38 новорожденных, из них 19 детей обследовано однократно, 14 —двукратно и 5 — трехкратно (проведено 62 анализа). Гликолипидные антитела выявлены у 38 детей (61 анализ), антитела к эшерихиям — у 34 (54) и к золотистому стафилококку—у 29 (51). Матерей обследовали однократно, некоторых - двукратно.

Эндотоксин определяли ЛАЛ-тестом [10, 11], позволяющим оценивать реакцию при концентрации эндотоксина 0,1 пг/мл [16]. Лабораторную посуду в алюминиевой фольге прогревали 3 ч при 300°. Капиллярную кровь брали после обработки кожи метанолом, этанолом и апирогенной водой, добавляли гепарин (10—15 ЕД/мл), сразу охлаждали до 4° и центрифугировали при 1000Xg в течение 10 мин. Ампулы с образцами плазмы закрывали парафильмом и замораживали при —20°. Срок хранения не превышал 2 месяца. Перед постановкой теста контрольные и опытные образцы разводили апирогенной водой (1 : 10), прогревали 10 мин в водяной бане при 80°, охлаждали, добавляли равный объем разведенного водой лизата амебоцитов и полученную смесь инкубировали 45 мин в термостате при 37°. Выраженность реакции оценивали визуально [10, 16] и с помощью микроскопа на основе разработанного нами метода кристаллографии. Степень полимеризации и кристаллизации субстрата в опытных и контрольных образцах сравнивали с известным содержанием стандартного эндотоксина (пирогенала), растворенного в апирогенной донорской плазме. В зависимости от состояния геля и дисперсности кристаллической сетки, образованной белковым лизатом в инертном разводящем растворе, различали образцы с содержанием эндотоксина 2,5—5—10— 15—20 пг/мл (рис.1), что соответствовало общепринятым 10 качественным критериям от (+-) до (3+). Чувствительность ЛАЛ-теста — 2,5 пг/мл эндотоксина в плазме, разведенной апирогенной водой (1 : 10). Плотный гель образовывался при концентрации эндотоксина 20 пг/мл и выше. Результаты реакции после специальной обработки документировали.

Рис. 1. Дисперсность кристаллической сетки в ЛАЛ-тесте в зависимости от концентрации токсина в плазме крови А—0 пг/мл, Б — 2,5 пг/мл, В — 5 пг/мл, Г —10 пг/мл, Д—15 пг/мл, Е — 20 пг/мл и больше. На участке Е — аморфная масса геля в виде темных пятен, деструкция сетки и свободные от белка зоны — в правом нижнем углу (ув. 7X20).

Титры гликолипидных антител определяли методом тонкослойного иммунного анализа [4, 12, 13] на основе подобранных нами оптимальных условий реакции и учета результатов. Полистироловые чашки Петри сенсибилизировали Re-гликолипидом штамма Salmonella minnesota R 595. Свободные сайты насыщали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Реакцию проводили 16—18ч в 1% агаре Дифко. Титр антител оценивали по диаметру зоны специфического крупнокапельного конденсата: 1:2 — до 0,9 мм; 1 : 4 —до 1,9 мм; 1 : 8 — до 2,9 мм; 1 : 16 — до 3,9 мм; 1 : 32 — до 4,9 мм; 1 : 64 — до 5,9 мм; 1 : 128 — до 6,9 мм и 1 : 256 — до 7,9 мм. В качестве контрольных образцов использовали гипериммунную плазму, истощенную на колонках, сенсибилизированных Re-гликолипидом (рис. 2). При параллельном определении в 10 образцax плазмы гликолипидных антител с помощью тонкослойного иммунного анализа (ТИА), реакций прямой агглютинации (РПГЛ) и иммуноферментного анализа наблюдалось совпадение результатов, но по чувствительности ТИА превосходил РПГА в 8 - 10 раз и на 2 порядка уступал иммуноферментному методу. Для постановки всех реакций требовалось 0,2 мл капиллярной крови.

Рис. 2. Зоны специфической конденсации паров при проведении тонкослойного иммунного анализа. K₁— гипериммунный образец, К₂— отрицательный контроль. А, Б, В — опытные образцы плазмы.

При определении методом ТИА титров антител против стафилококков и кишечной палочки использовали коммерческие термостабильные фракции фильтратов 5—6 суточных бульонных культур, которые содержали общие для исследуемых родов, бактерии антигенные детерминанты.

Результаты исследований представлены в таблице. Содержание эндотоксина у новорожденных с адаптационными реакциями (2 и 3-я группы) было выше, чем у здоровых детей. Эндотоксинемия при гипоксии (3-я группа) развивалась на фоне низких титров гликолипидных антител. При физиологических реакциях адаптации (2-я группа) титры энтеробактериальных антител у детей и у их матерей (5-я группа) превышали контрольные показатели. Эндотоксинемия у матерей новорожденных, перенесших асфиксию, была более выраженной, чем у матерей здоровых детей.

При обследовании 19 новорожденных из различных групп в динамике адаптационного периода колебания содержания эндотоксина (повышение или снижение) выявлены у 12 детей: в 1-й группе — у 2 (в пределах 5 пг/мл), во 2-й — у 3 (15 пг/мл), в 3-й — у 7 (20 пг/мл). Диагностическое (4-кратное) изменение титров антител к гликолипиду (исследовали парные образцы плазмы у 19 детей различных групп), кишечной палочке (у 16) и золотистому стафилококку (у 13) установлено соответственно у 9,5 и 6 новорожденных.

Содержание эндотоксина (пг/мл) и антител (обратные титры) Re-гликолипиду, эшерихиям и золотистому стафилококку в плазме новорожденных и их матерей (М±m)

Обследованные	Группы	Содержание
		эндотоксина, пг/мл	антител (обратные титры)
		эндотоксина, пг/мл	к Re-гликолипиду	к эшерихиям	к золотистому стафилококу
Новорожденные	1-ая	1,2±0,4 (26)	22,9±3,1 (26)	10,1±1,5 (25)	11,0±1,9 (24)
	2-ая	6,0±1,5* (13)	60,3±10,1*(13)	24,3±6,1*(12)	9,8±1,9 (12)
	3-ая	8,2±1,2* (23)	10,2±2.3*(22)	7,3±1,9 (17)	8,0±2,1 (15)
Матери	4-ая	2,4±0,9 (21)	16,4±2,6 (22)	10,4±1,9 (22)	9,1±1,7 (21)
	5-ая	1,3±0,5 (8)	96,0±26,4**(8)	38,9±9,1**(7)	6,9±2,6 (7)
	6-ая	6,8±1.9**(11)	47,3±14,9 (12)	23,7±6,0 (12)	14,6±3,4 (10)

Примечание. В скобках — количество исследований. * Р<0,06 по отношению к 1-й группе, **Р<0,05 по отношению к 4-й группе.

Эндотоксинемия у здоровых новорожденных, видимо, связана с развитием транзиторного дисбактериоза и сохраненных компенсаторных возможностей организма, что подтверждается достаточно высоким и стабильным уровнем антител при благоприятном течении периода адаптации. Более выраженная эндотоксинемия при ограничных состояниях, вероятнее всего, обусловлена физиологической диспепсией. У 2 детей с токсической эритемой нельзя было исключить повышенную чувствительность к эндотоксину. Развитие эндотоксинемии на фоне высоких титров антител против энтеробактерий указывает на дисфункцию других систем детоксикации [14]. Повышенное содержание эндотоксина на фоне низких титров гликолипидных антител у новорожденных, перенесших асфиксию, даже с учетом индивидуальных колебаний, в целом по группе свидетельствует о причинной взаимосвязи этих показателей и, видимо, отражает характерные для таких состояний общие процессы дезадаптации при неблагоприятном акушерском анамнезе, в частности дисбиотические изменения в желудочно-кишечном тракте [2]. Нарастание титров антител у детей этой группы связано с компенсаторными возможностями организма при нетяжелых формах асфиксии [7], что подтверждалось быстрым купированием симптомов и выпиской детей домой. Динамика титров антител против эшерихий и золотистых стафилококков свидетельствовала о физиологических реакциях системного иммунитета и указывала на этиологическое значение этих бактерий при адаптации, хотя в случаях повышения титров нельзя исключать и адьювантный эффект эндотоксина, что требует специального изучения (рис. З).

Эндотоксинемия у матерей с неблагоприятным акушерским анамнезом (6-я группа), видимо, является следствием активации грамотрицательной аутофлоры [9], что подтверждалось высоким уровнем антител против энтеробактерий у матерей новорожденных с компенсированными формами адаптационных реакций (5-я группа).

Выявленные нами высокие титры антител к гликолипиду у новорожденных при гладком течении раннего периода адаптации и низкие титры при неблагоприятном акушерском анамнезе и дезадаптации позволяют рассматривать их значения в прогностических целях при оценке резистентности организма.

Рис. 3. Динамика титров антител против Re-гликолипида (а), эшерихий (а₁), стафилококков (а₂) и концентрации эндотоксина (б) в плазме крови у новорожденного П., перенесшего асфиксию I степени.

По оси абсцисс—время после рождения в сутках (до выписки домой), по оси ординат— обратные значения титров (А) и концентрация эндотоксина в пг/мл. (Б). Столбики — соответствующие средние показатели у здоровых новорожденных.

ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружено развитие физиологической эндотоксинемии у новорожденных. Течение периода ранней неонатальной адаптации зависит от содержания в плазме крови детей эндотоксина и антител к Re-гликолипиду энтеробактерий.

2. У матерей новорожденных, перенесших асфиксию, на фоне неблагоприятного акушерского анамнеза содержание эндотоксина повышается по сравнению с матерями здоровых детей.

3. Оценка общей резистентности организма новорожденного возможна по содержанию антител к Re-гликолипида энтеробактерий.

4. Дисперсность кристаллической сетки в ЛАЛ-тесте зависит от концентрации эндотоксина в плазме крови.

ЛИТЕРАТУРА

1. Аполлонин А. В., Лиходед В. Г., Севастьянова Е. К.// Журн. микробиол.—1989.— № 2.—С. 96-100.

2. Гаврилов А. И.//Вопр. охр. мат.—1988.— № 4— С. 46—47.

3. Гаврюшов В. В., Сотникова К. А. Неонатология.—Л., 1985.

4. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций (под ред. Т. В. Перадзе, П. Халонена).— М., 1985.

5. Сергеев О. Е., Головина Н. М. Кишечные инфекции у новорожденных детей: Медицина и здравоохранение. Серия «Педиатрия».—М., 1989.— Вып. 2.— С. 60.

6. Шабалов Н. П., Ходов Д. А., Санталова Ф. П. и др. Неонатология,—М., 1988.

7. Шабалов Н. П., Ярославский В. К., Ходов Д. А., Любименко В. А. Асфикция новорожденных.—Л., 1990.

8. Яковлев М. Ю.//Казанский мед. ж.—1988.—№ 5.—С. 353—358.

9. Bhakoo О. N., Singh M.//Indian J. Pediatr.—1988.—Vol. 55.—P. 941—946.

10. Bode C, Kugler V., Bode J. C.//J. Hepatol.—1987.—Vol. 4.—P. 8—14.

11. Cox M. С. MD, MacDonald P. С. MD, Casey M. L Ph. D.//Am. J. Obstet Cynecol.— 1988.—Vol. 159.—P; 99—106.

12. Elwing H., Lange S., Nygren H.//J. Immunol. Meth.,— 1980.— Vol. 39.—P. 247—256.

13. Elwing H., Nilsson L.A. Ouchterlony O.//J. Immunol. Meth.— 1980.— Vol. 38.— P. 257—268.

14. Olson N. C, Salzer W. L., McCall С. E// Mol. aspects med.—1988.—Vol. 10.—P. 511-629.

15. Philippe J. J., De Buyzere M. L.//Acta Clinica Belgica.—1988.—Vol. 43.—P. 429— 436.

16. Roth R. I., Levin J., Behr S. J.//Lab. clin.. Med.—1989.—Vol. 114.—P. 306-311.

Поступила 27.11.91.

ENDOTOXINEMIA IN EARLY PERIOD OF ADAPTATION IN INFANTS AND THEIR MOTHERS

R. A. Urazaev, A. N. Krupnik,, M. Yu. Yakovleo

Summary

Endotoxin concentration is determined in blood plasma in 37 infants, and antibody titer to Re-glycolipid of enterobacteria, escherichia and goldish staphylococci is investigated by thin-layered immune analysis. The development of physiologic endotoxinemia is stated and the dependence of the content of endotoxin and titers of Re-antibodies in infants on the course of early period of adaptation and
health state of their mothers.